331/2004 Sb.



VYHLÁŠKA



ze dne 4. května 2004



o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce

bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby



Změna: 328/2008 Sb.



Ministerstvo zemědělství stanoví podle § 88 odst. 2 zákona č. 326/2004

Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů,

(dále jen "zákon") k provedení § 71 odst. 1 písm. i) zákona:



§ 1



Předmět úpravy



Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství^1)

a upravuje opatření, která se uplatňují na území České republiky proti

šíření Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. subsp.

sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., původci

bakteriální kroužkovitosti bramboru, a Ralstonia solanacearum (Smith)

Yabuuchi et al., původci bakteriální hnědé hniloby, aby se



a) zabránilo výskytu a šíření,



b) zjistilo místo výskytu a rozsah rozšíření a



c) při zjištění výskytu se zabránilo jejich šíření a prováděla se

ochranná opatření s cílem jejich eradikace.



§ 2



Pojmy



Pro účely této vyhlášky se rozumí:



a) původcem kroužkovitosti - bakterie Clavibacter michiganensis (Smith)

Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.,



b) původcem hnědé hniloby - bakterie Ralstonia solanacearum (Smith)

Yabuuchi et al.,



c) hostitelskými rostlinami -



1. původce kroužkovitosti - brambor (Solanum tuberosum L.) s výjimkou

semen bramboru, a ostatní rostliny z čeledi lilkovitých (Solanaceae), u

nichž byla potvrzena možnost infekce původcem kroužkovitosti v

přirozených podmínkách,



2. původce hnědé hniloby - brambor (Solanum tuberosum L.) s výjimkou

semen bramboru, rajče jedlé (Lycopersicon lycopersicum L.) kromě semen

a plodů, lilek potměchuť (Solanum dulcamara L.) a ostatní rostliny z

čeledi lilkovitých (Solanaceae), u nichž byla potvrzena možnost infekce

původcem hnědé hniloby v přirozených podmínkách,



d) detekčním průzkumem - průzkum zaměřený na zjišťování výskytu původce

kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby v určitém území nebo v určité

partii,



e) vymezovacím průzkumem - průzkum k určení rozsahu a původu zamoření

původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby, k určení způsobu

šíření infekce a k určení hranic území, na které se vztahují mimořádná

rostlinolékařská opatření podle § 76 zákona,



f) pravděpodobným zamořením původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé

hniloby - podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé

hniloby v rostlině, zásilce, partii, zařízení, stroji, dopravním

prostředku, skladu nebo jejich části a veškerých jiných předmětech

včetně obalového materiálu, podle § 11 odst. 1 zákona,



g) možným rozšířením původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby

- podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby

na pozemku, v objektu anebo v území, podle § 11 odst. 1 zákona,



h) zamořením původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby -

výskyt původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle § 11

odst. 1 zákona,



i) karanténním územím - území vymezené Státní rostlinolékařskou správou

(dále jen "rostlinolékařská správa"), na které se vztahují mimořádná

rostlinolékařská opatření podle § 76 odst. 1 zákona z důvodu potvrzení

výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby,



j) bezpečnostní zónou - území vymezené rostlinolékařskou správou, na

které se vztahují mimořádná rostlinolékařská opatření podle § 76 zákona

z důvodu podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé

hniloby,



k) klonově příbuznou partií - partie hostitelské rostliny, která

vznikla vegetativním množením z jedné původní partie; přitom se za:



1. sesterské klonově příbuzné partie považují klonově příbuzné partie,

které vznikly v témže roce vegetativním množením z jediné rodičovské

partie, v případě rajčete rostliny, které vyrostly ze stejné partie

osiva,



2. rodičovskou klonově příbuznou partii považuje partie klonově

příbuzná sesterským klonově příbuzným partiím, které z ní bezprostředně

vznikly.



§ 3



Průzkum výskytu původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby



(1) Rostlinolékařská správa provádí každoročně v souladu s § 10 odst. 1

zákona systematický průzkum výskytu původce kroužkovitosti a původce

hnědé hniloby v rozsahu podle odstavců 2 až 7.



(2) Detekčnímu průzkumu výskytu původce kroužkovitosti a původce hnědé

hniloby podléhají



a) rozmnožovací materiál bramboru^2) původem z České republiky v

rozsahu podle § 8 odst. 2,



b) namátkově vybrané partie rozmnožovacího materiálu bramboru^2)

původem ze členských států Evropské unie (dále jen "členský stát"),



c) namátkově vybrané partie nesadbových brambor původem z České

republiky a z ostatních členských států,



d) všechny partie bramboru vypěstované v bezpečnostní zóně vymezené

podle § 5 odst. 1 písm. c).



(3) Vymezovacímu průzkumu na výskyt původce kroužkovitosti nebo původce

hnědé hniloby podléhají všechny partie hostitelských rostlin označené

jako podezřelé z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé

hniloby a všechny partie hostitelských rostlin vypěstované v

karanténním území vymezeném podle § 5 odst. 1 písm. c).



(4) Zjišťování původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby při

rostlinolékařské kontrole zásilek dovážených ze třetích zemí a

vyvážených do třetích zemí podléhají



a) všechny dovážené partie rozmnožovacího materiálu bramboru^2) a

namátkově vybrané partie ostatních brambor,



b) všechny partie bramboru určené k vývozu do třetích zemí.



(5) Detekčnímu průzkumu na výskyt původce hnědé hniloby navíc podléhají



a) porosty rostlin rajčete určených k dalšímu pěstování,



b) vodní zdroje používané k závlaze hostitelských rostlin původce hnědé

hniloby včetně doprovodných hostitelských rostlin a odpadní vody ze

zpracovatelských podniků, které průmyslově zpracovávají hlízy bramboru,

popřípadě také pevné odpady z těchto podniků.



(6) Vymezovacímu průzkumu výskytu původce hnědé hniloby navíc podléhají

v případě podezření z výskytu nebo potvrzení jeho výskytu vodní zdroje

používané k závlaze partií podezřelých z výskytu a plevelné hostitelské

rostliny, popřípadě také pěstební substrát v místech produkce, odkud

tyto partie pocházejí.



(7) Výskyt původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby se zjišťuje



a) laboratorním testováním vzorků hlíz bramboru odebraných v případech

uvedených v odstavci 2 písm. a) a b), odstavci 3 a v odstavci 4 písm.

b) z porostů nebo ze skládek, v případě uvedeném v odstavci 4 písm. a)

z dovážených partií,



b) prohlídkou celých rostlin bramboru a řezu dužninou hlíz, v porostech

nebo ve skládkách, popřípadě také laboratorním testováním vzorků hlíz

bramboru, v případech uvedených v odstavci 2 písm. c) a d),



c) prohlídkou porostů rajčete ve vhodnou dobu s následným laboratorním

testováním vzorků rostlin s příznaky napadení původcem hnědé hniloby v

případech uvedených v odstavci 5 písm. a),



d) laboratorním testováním vzorků vody, pěstebního substrátu, pevných

odpadů nebo hostitelských rostlin pobřežní vegetace v případě uvedeném

v odstavci 5 písm. b) a v odstavci 6.



(8) Způsob prohlídky partie a počet, původ, složení a dobu odběru

vzorků při průzkumu, prováděném podle odstavců 2 až 7, rozsah tohoto

průzkumu a způsob předávání informací o odebraných a testovaných

vzorcích stanovuje v souladu s § 10 odst. 1 zákona rostlinolékařská

správa na základě uznávaných vědeckých a statistických zásad a biologie

původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby, s přihlédnutím k

systémům produkce brambor a dalších hostitelských rostlin a v

závislosti na aktuální situaci ve výskytu anebo na míře rizika

zavlečení původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby a zveřejní ve

Věstníku Státní rostlinolékařské správy (dále jen "Věstník"). Testování

odebraných vzorků pro zjištění a určení původce kroužkovitosti a

původce hnědé hniloby se provádí způsobem stanoveným v příloze č. 1

nebo stanoveným rostlinolékařskou správou v souladu s § 10 odst. 1

zákona a zveřejněným ve Věstníku.



(9) K průzkumu prováděnému podle odstavců 2 a 4 lze využít rovněž

vzorky úředně odebrané anebo testované fyzickou nebo právnickou osobou,

pověřenou k této činnosti Ministerstvem zemědělství podle § 71 odst. 1

písm. b) zákona nebo rostlinolékařskou správou podle § 72 odst. 5 písm.

i) zákona, pokud bude zajištěno na základě pravidelného dohledu této

správy, že vzorky budou odebírány a testovány způsobem stanoveným podle

odstavce 8.



(10) Výsledky průzkumu prováděného podle odstavců 2 až 6 oznamuje

písemně rostlinolékařská správa bez zbytečného odkladu právnické nebo

fyzické osobě, která vlastní příslušnou partii bramboru nebo rajčete a

nebo je oprávněna tuto partii uvádět na trh nebo ji pěstuje nebo

pěstovala, v případě rozmnožovacího materiálu^2) bramboru a rajčete

také Ústřednímu kontrolnímu a zkušebnímu ústavu zemědělskému.



(11) Podrobnosti o provádění průzkumu podle odstavců 2 až 8 předkládá

rostlinolékařská správa v souladu s § 10 odst. 5 zákona jednou ročně v

rozsahu stanoveném v příloze č. 2 části A ostatním členským státům a

Komisi za účelem zajištění srovnatelné úrovně potvrzování nepřítomnosti

původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby mezi členskými státy.

Výsledky úředních průzkumů provedených podle odstavců 2 až 6 oznamuje

rostlinolékařská správa jednou ročně ostatním členským státům a Komisi,

a to v případě průzkumu v rozmnožovacím materiálu bramboru,^2) množeném

pouze pro výsadbu na pozemcích množitele, do 1. září, v ostatních

případech do 1. června. Údaje oznámení o podrobnostech a výsledcích

průzkumu, týkající se porostů hostitelských rostlin, se vztahují vždy k

produkci předchozího roku. Podrobnosti tohoto oznámení jsou důvěrné.



§ 4



Opatření při zjištění podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo

původce hnědé hniloby



(1) Za podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé

hniloby se v souladu s § 11 odst. 1 zákona považuje



a) rostlinolékařskou správou ověřené zjištění vizuálních příznaků

napadení těmito škodlivými organismy a v případě původce hnědé hniloby

pozitivní výsledek rychlého screeningového testu podle přílohy č. 1

oddílu I číslo 1 a oddílu II, nebo



b) pozitivní výsledek screeningového testu provedeného

rostlinolékařskou správou nebo pod jejím dohledem způsobem stanoveným v

příloze č. 1.



(2) V případě podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo původce

hnědé hniloby rostlinolékařská správa v rámci odborného šetření podle §

76 odst. 7 zákona a zvláštního právního předpisu^3) zajistí provedení

úředního laboratorního testování, a to způsobem stanoveným podle § 3

odst. 8 a při dodržení podmínek stanovených v příloze č. 2 části B, s

cílem toto podezření potvrdit nebo vyvrátit.



(3) Rostlinolékařská správa zahájí neodkladně po zjištění podezření z

výskytu původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby odborné

šetření podle § 76 odst. 2 zákona za účelem zjištění původu podezřelého

výskytu a v souladu s § 11 odst. 1 zákona



a) zakáže přesun všech partií nebo zásilek, ze kterých byly odebrány

vzorky, s výjimkou těch, které jsou podrobeny opatření pod dohledem

rostlinolékařské správy, které vylučuje zjistitelné riziko rozšíření

původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby, a



b) nařídí vhodná opatření založená na stupni odhadovaného rizika

dalšího možného šíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé

hniloby s cílem tomuto šíření předejít včetně zákazu přesunu nebo

zajištění úředního dohledu nad přesunem všech ostatních partií

hostitelských rostlin na pozemcích a v objektech spojených s podezřením

z výskytu, popřípadě i mimo tyto pozemky a objekty.



(4) Při podezření na nebezpečí zamoření partií hostitelských rostlin

nebo, v případě původce hnědé hniloby, povrchových vod původem z jiného

členského státu nebo v některém jiném členském státě, sdělí

rostlinolékařská správa neprodleně úřední rostlinolékařské službě

příslušného členského státu podrobnosti týkající se tohoto podezření a

bude s tímto státem vhodným způsobem spolupracovat.



(5) Pokud bude o podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo

původce hnědé hniloby, které může mít původ v České republice nebo

které může Českou republiku ohrozit, informována Česká republika,

nařídí rostlinolékařská správa vhodná opatření podle odstavců 2 a 3.



§ 5



Opatření při potvrzení výskytu původce kroužkovitosti nebo původce

hnědé hniloby



(1) Pokud úřední laboratorní testování odebraných vzorků způsobem

stanoveným podle § 3 odst. 8 potvrdí výskyt původce kroužkovitosti nebo

původce hnědé hniloby, rostlinolékařská správa v souladu s § 76 odst. 2

zákona a s přihlédnutím k aktuálním vědeckým výsledkům, biologii

původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby a ke způsobu pěstování,

uvádění na trh a průmyslového zpracování hostitelských rostlin



a) označí za zamořené rostliny, zásilku, anebo partii, a zařízení,

stroje, dopravní prostředky, sklady nebo jejich části a veškeré jiné

objekty včetně obalového materiálu, z něhož byl vzorek odebrán, a které

přišly do styku s uvedeným rostlinným materiálem, ze kterého byl vzorek

odebrán, a místo nebo místa produkce včetně těch, kde je možná úplná

výměna pěstebního substrátu, a pozemek, na nichž byly zamořené rostliny

vypěstovány a odkud byl vzorek odebrán,



b) provede odborné šetření zaměřené na zjištění rozsahu pravděpodobného

zamoření a prvotního zdroje nákazy v souladu s ustanovením bodu 1

přílohy č. 3 včetně testování klonově příbuzných partií hostitelských

rostlin podle § 6 a stanoví v souladu s ustanovením bodu 2 přílohy č. 3

rozsah pravděpodobného zamoření prostřednictvím předsklizňového nebo

posklizňového kontaktu, a na základě klonové příbuznosti, pěstování,

zavlažování a zalévání nebo jiné pěstitelské vazby se zamořeným

předmětem nebo objektem, označeným podle písmene a),



c) vymezí karanténní území na základě označení zamořených předmětů nebo

objektů podle písmene a) a bezpečnostní zónu na základě stanovení

rozsahu pravděpodobného zamoření podle písmene b) a možného rozšíření

původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby v souladu s

ustanovením bodu 3 přílohy č. 3.



(2) V případě potvrzení výskytu původce hnědé hniloby s ohledem na

povrchovou vodu, odpadní vodu ze zařízení na zpracování a balení

brambor a s ohledem na hostitelské rostliny z čeledi lilkovitých z

doprovodné vegetace, jejichž prostřednictvím by při zavlažování,

zalévání nebo zaplavení povrchovou vodou mohlo být ohroženo pěstování

brambor, rostlinolékařská správa



a) zajistí úřední laboratorní testování odebraných vzorků povrchových

vod a popřípadě hostitelských rostlin z čeledi lilkovitých způsobem

stanoveným v příloze č. 1 ve vhodných termínech s cílem určit rozsah

zamoření,



b) označí v souladu s pozitivními výsledky úředního laboratorního

testování podle písmene a) povrchovou vodu, z níž byly odebírány

vzorky, za zamořenou,



c) vymezí karanténní území na základě označení povrchové vody za

zamořenou podle písmene b) a bezpečnostní zónu na základě stanovení

rozsahu pravděpodobného zamoření původcem hnědé hniloby a jeho možného

rozšíření podle bodu 3 přílohy č. 3.



(3) Rostlinolékařská správa neprodleně oznámí ostatním členským státům

a Komisi v souladu s ustanovením bodu 4 přílohy č. 3 potvrzený výskyt

původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle odstavce 1

písm. a), popřípadě odstavce 2 písm. b), a sdělí podrobnosti o vymezení

karanténního území a bezpečnostní zóny podle odstavce 1 písm. c),

popřípadě odstavce 2 písm. c). Podrobnosti o tomto oznámení jsou

důvěrné.



(4) Pokud jiný členský stát potvrdí výskyt původce kroužkovitosti nebo

původce hnědé hniloby v rostlině, zásilce anebo partii původem z České

republiky v oznámení učiněném obdobně podle odstavce 3,

rostlinolékařská správa odpovídajícím způsobem a v souladu s

ustanovením odstavců 1 a 2 označí zamořené předměty a objekty, stanoví

rozsah pravděpodobného zamoření a vymezí karanténní území, popřípadě

bezpečnostní zónu.



(5) Rostlinolékařská správa stanoví úředním sdělením ve Věstníku zásady

pro vedení odborného šetření podle odstavce 1 písm. b) a pro stanovení

rozsahu karanténního území a bezpečnostní zóny, vymezovaných podle

odstavce 1 písm. c), odstavce 2 písm. c) a odstavce 4.



§ 6



Testování klonově příbuzných partií hostitelských rostlin



(1) Rostlinolékařská správa zajistí laboratorní testování podle § 4

odst. 2 všech dohledaných partií hostitelských rostlin klonově

příbuzných k partiím, které byly označeny za zamořené podle § 5 odst. 1

písm. a), v každém případě však všechny klonově příbuzné partie

rozmnožovacího materiálu^2), a to v rozsahu potřebném ke stanovení

prvotního zdroje nákazy a rozsahu možného zamoření s cílem stanovit

míru rizika dalšího šíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé

hniloby.



(2) Podle výsledku testování podle odstavce 1 rostlinolékařská správa v

případě potřeby označí další předměty a objekty za zamořené, rozšíří

rozsah možného zamoření a nově vymezí karanténní území a bezpečnostní

zónu podle § 5 odst. 1 písm. a), b) a c).



§ 7



Opatření proti šíření původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby



(1) Rostlinolékařská správa v souladu s § 11 odst. 1 zákona nařídí tato

mimořádná rostlinolékařská opatření podle § 76 odst. 2 zákona:



a) partie hostitelských rostlin označená za zamořenou podle § 5 odst. 1

písm. a) nesmí být sázena a pod dohledem rostlinolékařské správy se s

ní naloží způsobem uvedeným v bodě 1 přílohy č. 4, pokud

rostlinolékařská správa předem ověří, že neexistuje rozpoznatelné

riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby a že

jsou splněny požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v příloze č.

5, v případě průmyslového zpracování této partie,



b) partie hostitelských rostlin označená jako pravděpodobně zamořená

podle § 5 odst. 1 písm. b) smí být použita pod dohledem

rostlinolékařské správy způsobem uvedeným v bodě 2, popřípadě 3 přílohy

č. 4, pokud rostlinolékařská správa předem ověří, že neexistuje

rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti nebo původce

hnědé hniloby a že jsou splněny požadavky na zneškodňování odpadů,

stanovené v příloze č. 5, v případě průmyslového zpracování této

partie, a pokud není tato partie na základě výsledku testování klonově

příbuzných partií hostitelských rostlin podle § 6 označena jako

zamořená podle § 5 odst. 1 písm. a),



c) zařízení, stroje, dopravní prostředky, sklady nebo jejich části a

veškeré jiné objekty včetně obalového materiálu, označené za zamořené

podle § 5 odst. 1 písm. a) nebo označené jako pravděpodobně zamořené

podle § 5 odst. 1 písm. b), se buď zničí nebo podrobí očistě a

dezinfekci pomocí vhodných metod uvedených v příloze č. 6 s tím, že po

provedení očisty a dezinfekce se tyto objekty a předměty za zamořené

ani za pravděpodobně zamořené nepovažují,



d) v karanténním území a bezpečnostní zóně, vymezených podle § 5 odst.

1 písm. c), popřípadě podle § 5 odst. 2 písm. c), musí být provedena

opatření stanovená v případě výskytu původce kroužkovitosti v bodě 4

přílohy č. 4 a v případě výskytu původce hnědé hniloby v bodě 5 přílohy

č. 4.



(2) Rostlinolékařská správa může nařídit podle § 11 odst. 1 zákona

přísnější mimořádná rostlinolékařská opatření proti šíření původce

kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby než opatření uvedená v

odstavci 1, pokud budou tato opatření odborně odůvodněná, splnitelná a

účinná. Podrobnosti o těchto opatřeních a o opatřeních nařízených podle

odstavce 1 písm. d) uvnitř karanténního území a v bezpečnostní zóně

sděluje rostlinolékařská správa ostatním členským státům a Komisi spolu

s registračním číslem dotčených povinných osob, registrovaných podle §

12 odst. 1 zákona.



(3) Rostlinolékařská správa zruší podle § 76 odst. 4 písm. b) zákona

mimořádná rostlinolékařská opatření nařízená podle odstavce 1 a

odstavce 2 po jejich splnění a po uplynutí doby stanovené k jejich

splnění.



(4) Přechovávání původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby je v

souladu s § 7 odst. 1 zákona zakázáno s výjimkou jejich přechovávání k

vědeckým, šlechtitelským nebo diagnostickým účelům, které povoluje

rostlinolékařská správa podle § 8 odst. 1 zákona, pokud tím nebudou

narušena ochranná opatření při jejich výskytu ani nevznikne riziko

jejich šíření.



§ 8



Testování rozmnožovacího materiálu^2) bramboru



(1) Rozmnožovací materiál^2) bramboru, vypěstovaný na území České

republiky a uváděný na trh, musí být podroben laboratornímu testování,

prováděnému v rámci detekčního průzkumu podle § 3 odst. 2, v rozsahu

podle odstavce 2 a v souladu s § 3 odst. 8 a 9, a shledán prostým

původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby.



(2) Testování podle odstavce 1 se v příslušném sklizňovém roce podrobí



a) rostliny šlechtitelského rozmnožovacího materiálu^4) bramboru určené

k výrobě předstupňů a reprezentativní vzorky všech partií

rozmnožovacího materiálu bramboru, pokud byl v posledním uplynulém

sklizňovém roce v partii rozmnožovacího materiálu^2) bramboru původem z

České republiky potvrzen výskyt původce kroužkovitosti, a nebo



b) pokud byl v posledním uplynulém sklizňovém roce v partii

rozmnožovacího materiálu^2) bramboru původem z České republiky potvrzen

výskyt původce hnědé hniloby, buď



1. rostliny šlechtitelského rozmnožovacího materiálu^4) bramboru a

předstupňů a reprezentativní vzorky všech partií základního

rozmnožovacího materiálu bramboru v případech potvrzené klonové

souvislosti se zaměřením na tuto souvislost, nebo



2. reprezentativní vzorky všech partií základního rozmnožovacího

materiálu bramboru nebo předstupňů a šlechtitelského rozmnožovacího

materiálu bramboru^4) v případech, u nichž prokazatelně neexistuje

žádná klonová souvislost, nebo



c) rostliny šlechtitelského rozmnožovacího materiálu bramboru^4) nebo

reprezentativní vzorky všech partií základního rozmnožovacího materiálu

bramboru nebo předstupňů, nebo všech partií rozmnožovacího materiálu

bramboru určených k množení v následujícím roce, pokud výskyt původce

kroužkovitosti ani původce hnědé hniloby nebyl v posledním uplynulém

sklizňovém roce potvrzen v partii rozmnožovacího materiálu^2) bramboru

původem z České republiky.



§ 9



Účinnost



Tato vyhláška nabývá účinnosti dnem jejího vyhlášení.



Ministr:



Ing. Palas v. r.



Příloha 1



A. METODY DIAGNÓZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PŮVODCE KROUŽKOVITOSTI



Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou

součástí:



i) diagnózy kroužkovitosti v hlízách bramboru a rostlinách bramboru,



ii) detekce



Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus ve vzorcích hlíz bramboru a rostlin bramboru,



iii) identifikace



Clavibacter michiganensis

subsp.



sepedonicus

.



OBECNÉ ZÁSADY



Optimalizované protokoly pro různé metody, validovaná činidla a

podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou

uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na

optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku č. 1.



Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují

použití životaschopných kultur



Clavibacter michiganensis

subsp.



sepedonicus

jako kontrolních materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních

podmínek s odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek

příslušných povolení vydaných rostlinolékařskou správou. Testovací

parametry musí zajistit stálé a reprodukovatelné zjištění úrovní

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jako stanovené prahy

vybraných metod.



Zcela nezbytná je příprava pozitivních kontrol. Testování podle

požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení, údržbu a kalibraci

zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich uchovávání a všechna

opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky, např. oddělení

pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být uplatněno

standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním a jiným

chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.



Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní

výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na

vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech.



Pokud je první screeningový test (IF nebo PCR/FISH) pozitivní, existuje

podezření na infekci původcem kroužkovitosti a musí být proveden druhý

screeningový test. Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je

podezření z výskytu potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle

daného schématu. Pokud je druhý screeningový test negativní, pak vzorek

není považován za infikovaný původcem kroužkovitosti. Z toho důvodu je

pozitivní IF test podle § 4 odst. 1 definován jako pozitivní výsledek

IF testu potvrzený druhým screeningovým testem (PCR/FISH).



Potvrzená přítomnost vyžaduje izolaci a identifikaci čisté kultury



Clavibacter michiganensis

subsp.



sepedonicus

s potvrzením patogenity.



1. Použití postupových diagramů



1.1. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti v

hlízách bramboru a v rostlinách bramboru vykazujících příznaky

bakteriální kroužkovitosti



Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z

výskytu nebo typickými příznaky kroužkovitosti. Zahrnuje rychlý

screeningový test, izolaci patogenu z infikovaného vodivého pletiva na

diagnostickém médiu a v případě pozitivního výsledku identifikaci

kultury



Clavibacter michiganensis

subsp.



sepedonicus

.





(1) Popis příznaků je v oddíle 2.



(2) Vhodné testy jsou: - IF test (oddíl 4),



- PCR test (oddíl 6),



- FISH test (oddíl 5).



(3) Ačkoli izolace patogena z rostlinného materiálu s typickými

příznaky roztíráním suspenzí na média není komplikovaná, kultivace v

pokročilých stádiích infekce se nemusí podařit. Saprofytické bakterie,

které rostou na infikovaném pletivu, mohou přerůst nebo potlačovat

patogena na izolačním médiu. Proto se doporučuje používat neselektivní

i selektivní média, nejlépe MTNA (oddíl 8) nebo biotest (oddíl 7).



(4) Popis typické morfologie kolonie je v oddíle 8.



(5) Pokud je izolační zkouška negativní, ale příznaky choroby jsou

typické, musí být izolace provedena znovu.



(6) Spolehlivé identifikace čisté kultury Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus se dosáhne za použití testů uvedených v oddílu 9.



(7) Zkouška patogenity je popsána v oddíle 10.



1.2. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve

vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru Postup testování je určen ke

zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru. Pozitivní výsledek z

nejméně dvou screeningových testů, z nichž každý je založen na jiném

biologickém principu, musí být doplněn izolací patogena, a následně, v

případě izolace typických kolonií, potvrzením, že čistá kultura je



Clavibacter michiganensis

subsp.



sepedonicus

. Pozitivní výsledek pouze jednoho screeningového testu není

dostačující k tomu, aby byl vzorek považován za podezřelý.



Screeningové a izolační testy musí umožnit detekční práh 103 až 104

buněk/ml resuspendované pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé

sérii testů.





(1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použít i

na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.



(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.1.



(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických

principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede

se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je

vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní,

je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo

více screeningových testů založených na různých biologických

principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek

považován na negativní. Další testy nejsou nutné.



(4) Test imunofluorescence (IF).



Pro vyšetření IF se vždy použije polyklonální protilátka, další

monoklonální protilátky umožní větší přesnost (viz oddíl 4).



(5) PCR test.



Použijí se vhodná validovaná PCR činidla a protokoly (viz oddíl 6).



(6) FISH test.



Použijí se validovaná činidla a protokoly (viz oddíl 5).



(7) Selektivní izolace.



Toto může být v mnoha případech vhodná metoda pro přímou izolaci

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus za použití MTNA média nebo

NCP-88 média a ředění resuspendované pelety 1/100. Typické kolonie lze

získat během 3-10 dní po rozetření na médium. Kulturu patogena lze

následně vyčistit a identifikovat. Pro úplné využití potenciálu test

vyžaduje opatrnou přípravu pletiva z pupkové části, aby se omezily

sekundární bakterie, které jsou konkurencí Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus na médiu a které mohou patogena přerůst. Pokud se

kultivační metoda takto nepodaří, musí být izolace provedena z rostlin

použitých pro biotest (viz oddíl 8).



(8) Biotest se používá k izolaci Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus z pelet bramborových extraktů pomocí selektivního obohacení

v rostlinách lilku vejcoplodého (Solanum melongena). Test vyžaduje

optimální inkubační podmínky stanovené pro tuto metodu. Bakteriální

inhibitory Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na MTNA nebo

NCP-88 médiu pravděpodobně tento test narušovat nebudou (viz oddíl 7).



(9) Typická morfologie kolonie je popsána v oddílu 8.



(10) Kultivace nebo biotesty mohou selhat z důvodů konkurence nebo

inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových

testů pozitivní, ale izolační testy negativní, opakují se izolační

testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním vodivého pletiva z

blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku a v případě potřeby se

provede test dalších vzorků.



(11) Spolehlivá identifikace čistých kultur podezřelých na Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus se dosáhne použitím testů popsaných v

oddílu 9.



(12) Test patogenity je popsán v oddílu 10.



1.3. Postupový diagram pro diagnózu bakteriální kroužkovitosti ve

vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru





(1) Doporučené velikosti vzorků – viz oddíl 3.2.



(2) Metody extrakce a koncentrace patogena jsou popsány v oddílu 3.2.



(3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických

principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede

se nejméně jeden screeningový test. Pokud je tento test negativní, je

vzorek považován za negativní. V případě, že je tento test pozitivní,

je pro ověření prvního pozitivního výsledku nezbytné provedení druhého

nebo více screeningových testů založených na různých biologických

principech. Pokud je druhý nebo další test negativní, je vzorek

považován za negativní. Další testy nejsou nutné.



(4) Selektivní izolační test a typická morfologie kolonie jsou popsány

v oddílu 8.



(5) IF test je popsán v oddílu 4.



(6) PCR test je popsán v oddílu 6.



(7) FISH test je popsán v oddílu 5.



(8) Biotest je popsán v oddílu 7.



(9) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo

inhibice saprofytickými bakteriemi. Pokud jsou výsledky screeningových

testů pozitivní, ale izolační testy jsou negativní, opakují se izolační

testy a v případě potřeby se provede test dalších vzorků.



(10) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že

se jedná o Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, se dosáhne

pomocí testů popsaných v oddílu 9.



(11) Test patogenity je popsán v oddílu 10.



2. Vizuální vyšetření na přítomnost příznaků kroužkovitost

i



2.1. Rostliny bramboru



V evropských klimatických podmínkách se příznaky na poli zjistí jen

zřídkakdy a často pak až na konci sezóny. Kromě toho jsou příznaky

skryté nebo se zamění s příznaky jiných chorob, stáří nebo mechanických

poškození. Proto mohou být příznaky při kontrole na poli snadno

přehlédnuty. Příznaky vadnutí jsou velmi odlišné od příznaků hnědé

hniloby; vadnutí je obvykle pomalé a zpočátku omezené na okraje listů.

Mladé infikované listy často i přes infekci nadále rostou, i když růst

v infikovaných místech je omezený. Tím vznikají neobvykle tvarované

listy. Listy postižené ucpáním vodivých pletiv na spodní části stonku

často mají chlorotické, žluté až oranžové mezižeberní partie.

Infikované děložní lístky, listy a dokonce stonky mohou eventuálně

odumřít. Často jsou listy a hlízy pouze menší. Příležitostně jsou

rostliny zakrnělé. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové

stránce http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.



2.2. Hlízy bramboru



Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva

bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec

svazků cévních na pupkovém konci hlízy může mít nepatrně tmavší

zbarvení než obvykle. Prvním dobře identifikovaným příznakem je žlutavé

zabarvení prstence cévních svazků a stav, kdy při jemném zmáčknutí

hlízy vystupují z cév sloupky sýrovité hmoty. Tento exsudát obsahuje

miliony bakterií. Vodivá pletiva mohou zhnědnout a příznaky na hlízách

jsou v tomto stádiu podobné příznakům hnědé hniloby způsobené Ralstonia

solanacearum. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část

prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkové části a mohou se

postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci

vodivých pletiv: vnější korová část se může oddělit od vnitřní korové

části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy

praskliny, často s červenohnědými okraji. V poslední době se v Evropě

objevilo několik případů, kdy střední kůra hnije s prstencem svazků

cévních, čímž dochází k druhotnému poškození se vznikem vnitřních dutin

a nekrózy. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky

maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky

kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru. Možné jsou i atypické

příznaky. Barevné snímky řady příznaků jsou na internetové stránce

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.



3. Příprava vzorků



3.1. Hlízy bramboru



Poznámka:



- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na 1 test. Intenzivnější

vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší

množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu

výsledků. Postup však lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200

hlízami, pokud je k dispozici menší množství hlíz.



- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na

testování vzorků o velikosti 200 hlíz.



- Níže popsaný bramborový extrakt lze použít také pro zjištění původce

hnědé hniloby,



Ralstonia solanacearum

.



Nepovinné ošetření před přípravou vzorku:



Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné dezinfekční prostředky (s obsahem

chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění možné

patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají

oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je obzvlášť užitečný v případě,

že je ve vzorku příliš zeminy a jestliže se má provádět PCR test nebo

přímá izolace.



3.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nožem či škrabkou

na brambory se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy. Opatrně

se vyříznou konické výkrojky vodivého pletiva z pupkových konců

brambor. Na minimum se omezí nadbytečná část pletiva nezahrnující cévní

svazky. Po odebrání musí být výkrojky z pupkových konců zpracovány do

24 hodin nebo konzervovány při - 20°C po dobu nejdéle dvou týdnů.



Všechny hlízy s podezřelými příznaky bakteriální kroužkovitosti se dají

stranou a testují se odděleně. Pokud jsou při vyříznutí výkrojku z

pupkového konce zjištěny příznaky kroužkovitosti, provede se vizuální

vyšetření této hlízy po naříznutí hlízy na pupkovém konci. Všechny

naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se nechají korkovatět po dobu 2

dnů při pokojové teplotě a uchovávají se v karanténě při teplotě 4 – 10

°C až do ukončení všech testů. Všechny hlízy ve vzorku se uchovávají

podle přílohy č. 2.



3.1.2. Výkrojky z pupkové části se shromáždí v nepoužitých nádobách na

jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě,

že jsou nádoby znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a

dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat

výkrojky z pupkového konce okamžitě, pokud to není možné, uchovávají se

v nádobě bez přidání pufru, v chladu po dobu maximálně 72 hodin nebo

při pokojové teplotě maximálně 24 hodin. Schnutí a suberizace výkrojků

a růst saprofytů v průběhu skladování může bránit zjištění přítomnosti

bakterie způsobující kroužkovitost.



3.1.3. Výkrojky z pupkového konce se zpracují jedním z následujících

postupů:



a) výkrojky se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml)

extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají se v rotační třepačce (50-100

ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24

hodin chlazené;



nebo



b) výkrojky se homogenizují s dostatečným množstvím (přibližně 40 ml)

extrakčního pufru (dodatek 3), buď v mixéru nebo rozdrcením v utěsněném

jednorázovém maceračním sáčku za použití gumového tloučku nebo vhodného

mlecího zařízení.



Poznámka:



Při homogenizaci vzorků za použití mixéru existuje vysoké nebezpečí

křížové kontaminace vzorků. Je nutno učinit bezpečnostní opatření pro

zamezení vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakce. Pro každý vzorek

musí být použita čerstvě sterilizovaná ostří (nože) a nádoby. Pokud má

být použit PCR test, je nutno zamezit přenosu DNA na nádoby nebo mlecí

zařízení, doporučuje se drcení v sáčcích na jedno použití a použití

zkumavky na jedno použití.



3.1.4. Dekantuje se supernatant. Pokud je nadměrně zakalený, pročistí

se buď pomalým odstředěním (při maximálně 180 g po dobu 10 minut při

teplotě 4-10°C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje

přídavkem (10 ml) extrakčního pufru (dodatek 3).



3.1.5. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním při 7000 g po dobu

15 minut (nebo 10 000 g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10°C a odstraní

se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.



3.1.6. Resuspenduje se peleta v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 3).

Použije se 500 µl pro test na Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus, 500 µl pro Ralstonia solanacearum a 500 µl pro referenční

účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10-25 % (v/v)

k 500 µl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá

se vířením a uloží při teplotě - 16 až -24°C (týdny) nebo při teplotě

-68 až -86°C (měsíce). Extrakty se během testování uchovávají při

teplotě 4-10°C.



Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.



Pokud je nutný transport extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu

do 24 až 48 hodin.



3.1.7. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a

vzorky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zacházelo odděleně,

aby se předešlo kontaminaci. To platí i pro sklíčka na IF testy a

všechny testy.



3.2. Rostliny bramboru



Poznámka:



Pro zjištění latentních populací Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus se doporučuje kontrola kombinovaných vzorků. Postup je

vhodný pro kombinované vzorky až 200 částí stonků. (Pokud se provádí

podrobné průzkumy, měly by být založeny na statisticky reprezentativním

vzorku rostlinné populace, která je předmětem vyšetřování.)



3.2.1 Pomocí čistého dezinfikovaného nože nebo zahradnických nůžek se

odstraní část o velikosti 1-2 cm ze spodní strany každého stonku přímo

nad povrchem země. Části stonků se krátce dezinfikují etanolem 70 %,

okamžitě osuší savým papírem a shromažďují v uzavřené sterilní nádobě.



3.2.2. Části stonků se zpracují jedním z následujících postupů:



a) části se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního

pufru (dodatek 3) a třepají v rotační třepačce (50-100 ot/min) po dobu

4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16-24 hodin chlazené,

nebo



b) části se okamžitě rozdrtí v pevném maceračním sáčku s přiměřeným

množstvím extrakčního pufru (dodatek 3) za použití gumového tloučku

nebo vhodného mlecího zařízení. Pokud to není možné, skladují se části

stonků v chladu maximálně 72 hodin nebo maximálně 24 hodin při pokojové

teplotě.



3.2.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.



3.2.4 Další purifikace extraktu nebo koncentrace bakteriální frakce

obvykle není nutná, ale lze ji dosáhnout filtrací a/nebo odstředěním

podle popisu v oddílu 3.1.3.-3.1.6.



3.2.5 Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na 2 stejné

části, Jedna polovina se udržuje během testování při teplotě 4-10 °C a

druhá polovina se skladuje s 10-25 % (v/v) sterilního glycerolu při

teplotě -16 až -24 °C (týdny) nebo při teplotě -68 až - 86 °C (měsíce),

pokud je nutné další testování.



4. IF test



PRINCIP



Doporučuje se použít IF test jako hlavní screeningový test, protože

byla prokázána jeho schopnost dosáhnout požadovaných prahů.



Použije-li se jako hlavní screeningový test a jeho výsledek je

pozitivní, musí být jako druhý screeningový test proveden test PCR nebo

FISH. Jestliže se test IF použije jako druhý screeningový test a jeho

výsledek je pozitivní, je pro dokončení analýzy nutné další testování

podle postupového diagramu.



Poznámka:



Pokud je IF test používán jako hlavní vyšetřovací test, používá se vždy

polyklonální protilátka. V případě pozitivního výsledku IF testu s

polyklonální protilátkou může být další vyšetření vzorku s monoklonální

protilátkou přesnější, ale méně citlivé.



Používají se protilátky proti známému kmenu původce kroužkovitosti -

ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Doporučuje se určovat titr pro

každou novou řadu proti látek. Titr je stanoven jako nejvyšší ředění,

při kterém dochází k optimální reakci při testování suspenze obsahující

105 až 106 buněk na 1 ml homologického kmene původce kroužkovitosti a

při použití vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC)

podle doporučení výrobce. Nezpracované polyklonální nebo monoklonální

protilátky by měly mít IF titr alespoň 1:2000. Během testu by se měly

protilátky používat v pracovním ředění (WD) v blízkosti titru nebo na

titru. Používají se validované protilátky (viz internetovou stránku

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).



Test se provádí na čerstvě připravených vzorkových extraktech. V

případě potřeby může být úspěšně proveden na extraktech skladovaných

při - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol lze ze vzorku odstranit

přidáním 1 ml peletového pufru (dodatek 4), opětovným odstředěním po

dobu 15 minut při 7 000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového

pufru. To často není nutné, zejména pokud jsou sklíčka se vzorky

fixována plamenem (viz 4.2).



Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem

nebo s jiným srovnávacím kmenem původce kroužkovitosti, suspendovaným

ve výluhu z brambor podle dodatku 2 a nepovinně v pufru.



Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo

zmrazením při teplotě -16 až -24 °C) by se mělo podle možnosti použít

jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.



Jako negativní kontroly se použijí alikvotní části vzorkových extraktů,

které byly předtím testovány s negativním výsledkem.



Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, nejlépe s 10 okénky o

průměru nejméně 6 mm.



Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako test

vzorků.



4.1. Sklíčka na test se připraví jedním z následujících postupů:



a) Pro pelety s relativně nízkým množstvím škrobového sedimentu:



Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je

vhodné 15 µl – pro větší okénka objem vyšší) roztoku resuspendované

bramborové pelety 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje

stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě.

Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle

obrázku 1.



b) Pro jiné pelety:



Připraví se desetinná ředění (1/10 a 1/100) resuspendované pelety v

peletovém pufru. Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o

průměru 6 mm je vhodné 15 µl – pro větší okénka objem vyšší)

resuspendované pelety 1/100 a každého roztoku do řady okének. Druhou

řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 2.



4.2. Vysuší se kapky při pokojové teplotě nebo zahřátím na teplotu 40

až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut

při teplotě 60 °C), nad plamenem nebo pomocí 95 % etanolu nebo podle

zvláštních pokynů dodavatelů protilátek.



V případě potřeby lze potom fixovaná sklíčka před dalším použitím

skladovat zmrazená v suchém boxu po co možná nejkratší dobu (maximálně

3 měsíce).



4.3. Postup IF testu:



a) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. a): Připraví se

sada dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl

být titr ˝ (T/2), v ostatních titr Ľ (T/4), titr ˝ (T/2), titr (T) a

dvojnásobný titr (2T).



b) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. b): Připraví se

pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje

přesnost.



Obrázek 1: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. a) a oddílu

4.3. písm. a)





Obrázek 2: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. b) a oddílu

4.3 b)





4.3.1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený papír. Každé

testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství

protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství

použitého extraktu.



Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek,

postupuje se následovně:



4.3.2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu

30 minut při pokojové teplotě (18-25 °C).



4.3.3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě

opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF

Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku

aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou

kontaminaci, a pečlivě odstranit přebytečnou vlhkost jemným osušením.



4.3.4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí

ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu

naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.



4.3.5. Zakrytá sklíčka se inkubují na vlhkém papíru po dobu 30 minut

při pokojové teplotě (18-25 °C).



4.3.6. Kapky konjugátu se setřesou ze sklíček a tato se opláchnou a

umyjí jako předtím (4.3.3.).



Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.



4.3.7. Napipetuje se 5-10 µl 0,1M fosfátového pufru s glycerolem

(dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží

krycí sklíčko.



4.4. Vyhodnocení IF testu



4.4.1. Testovací sklíčka se prohlížejí epifluorescenčním mikroskopem s

filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při

zvětšení 500x až 1000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých

průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se

zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu. Nejdřív se zkontroluje pozitivní

kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v

určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost

odchylná, musí být test IF opakován (oddíl 4).



4.4.2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou

morfologií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v testovacích

okénkách sklíčka (viz internetová stránka

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita

fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve

stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením

nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu. Při podezření z jakékoli

kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna

sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo

při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu

sklíček.



4.4.3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost

imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí

stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s

atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s

velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus.



4.4.4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí

a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 4.3.



4.4.5. Interpretace výsledku IF testu:



a) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se

odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a

vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek

4). Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na

1 ml resuspendované pelety nejméně 5x103. Vzorek je považován na

potenciálně infikovaný a je povinné další testování.



b) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než

5x103 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za

negativní. Další testování není nutné.



5. Test FISH



PRINCIP



Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní,

musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Když se

FISH test provede jako druhý screeningový test a je pozitivní, je k

dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.



Poznámka:



Používají se validované oligosondy specifické pro Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus (dodatek 7). Úvodní testování touto

metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň 103-104 buněk

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml přidané do extraktů

ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.



Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě

připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem,

který byl uchován v glycerolu při teplotě -16 až -24 nebo -68 až -86

°C. Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze

vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus s negativním výsledkem.



Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 105 až 106

buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na ml (např. kmen

NCPPB 4053 nebo PD 406) v 0,01 M fosfátového pufru (PB) z 3-5 denní

kultury (příprava viz dodatek 2). Připraví se samostatná sklíčka s

pozitivními kontrolními vzorky homologického kmene nebo jiného

referenčního kmene Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

suspendovaného v bramborovém extraktu podle dodatku 2.



Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu

procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve

vzorku.



Test kontrolního materiálu se provádí stejným způsobem jako u vzorků.



5.1. Fixace bramborového extraktu



5.1.1. Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7)



5.1.2. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy

mikrozkumavky a odstřeďujte po dobu 8 minut na 7 000 g.



5.1.3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta v 500 µl fixačního

roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje se

přes noc při teplotě 4 °C.



Alternativním fixačním činidlem je 96 % etanol. Pro jeho použití se

rozpustí peleta z kroku 5.1.2. v 50 µl 0,01 M PB a 50 µl 96 % etanolu.

Promíchá se protřepáním a inkubuje se při teplotě 4 °C po dobu 30-60

minut.



5.1.4. Odstřeďuje se po dobu 8 minut na 7 000 g, odstraní se

supernatant a resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01 M PB (viz dodatek 3).



5.1.5. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko,

jak ukazuje obrázek 3, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno

sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB).

Zbývající roztok vzorku (49µl) může být uložen při teplotě -20 °C po

přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH

metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním, přidá se stejné

množství 0,01 M PB a zamíchá se protřepáním.



Obrázek 3. Rozmístění na sklíčku FISH



5.1.6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo sušičkou sklíček

při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.



V této fázi je možnost postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další

den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při

pokojové teplotě.



5.2. Předhybridizace a hybridizace



5.2.1. Připraví se roztok lyzozymu obsahující 10 mg lyzozymu (Sigma

L-6876) v 10 ml pufru (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Tento

roztok lze skladovat, ale měl by se pouze jednou zmrazit a nechat

roztát. Každý vzorek se dobře pokryje přibližně 50 µl roztoku lyzozymu

a inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Potom se ponoří

sklíčka do demineralizované vody, pouze jednou, a osuší filtračním

papírem.



Alternativně se přidá místo lyzozymu 50 µl proteinázy K 40-400 µg.ml-1

v pufru (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2 , pH 7,4) do každé jamky a inkubuje

se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.



5.2.2. Buňky se suší ve stupňovaných sériích 50 %, 80 % a 96 % etanolu

pokaždé po dobu 1 minuty. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu v

držáku sklíček.



5.2.3. Připraví se vlhká inkubační komora zakrytím dna vzduchotěsné

krabice tkaninou nebo filtračním papírem namočeným v 1x hybmixu

(dodatek 7). Krabice se přeinkubuje v hybridizační peci při teplotě 55

°C po dobu alespoň 10 minut.



5.2.4. Připraví se hybridizační roztok (dodatek 7) s 45 µl na 1 sklíčko

a předinkubuje se po dobu 5 minut při teplotě 55 °C.



5.2.5. Sklíčka se umístí na horkou plotnu při teplotě 45 °C a do

každého ze 4 okének na sklíčku / sklíčcích se přidá 10 µl

hybridizačního roztoku.



5.2.6. Každé sklíčko se přikryje 2 krycími sklíčky (24 x 24 mm) tak,

aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předehřáté vlhké komory

a hybridizuje se 14 – 18 h v peci při teplotě 55 °C v temnu.



5.2.7. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l sterilní vody (Ultra pure

water = UPW), 1 l 1x hybmixu (334 ml 3x hybmix a 666 ml UPW) a 1 l 1/2

x hybmixu (167 ml 3x hybmix a 833 ml UPW). Každá z nich se přeinkubuje

ve vodní lázni při teplotě 55 °C.



5.2.8. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku

sklíček.



5.2.9. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince

s 1x hybmixem při teplotě 55 °C.



5.2.10. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/2 hybmix a

nechá se inkubovat dalších 15 minut.



5.2.11. Sklíčka se ponoří krátce do UPW a položí na filtrační papír.

Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním

papírem. Napipetuje se 5-10 µl krycího roztoku (např. Vectashield,

Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každé jamky a celé sklíčko

se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).



5.3. Hodnocení FISH testu



5.3.1. Sklíčka se prohlížejí ihned s mikroskopem vhodným pro

epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630x nebo 1 000x pod olejovou

imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou

eubakteriální buňky (včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku

zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro

tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává

se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků.

Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (oddíl

9.4) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlíží se okénka

napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde

nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí

mikroskopu.



5.3.2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií

charakteristickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v

okénkách testovacích sklíček (viz internetová stránka

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita

fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního

kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují

slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.



5.3.3. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován.

Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se

může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky

díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka

sklíček) na povrchu sklíček.



5.3.4. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost FISH testu. V

peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout

doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a

křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií

podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ačkoli mnohem

méně často než u IF testu.



5.3.5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí

a morfologií, viz 5.3.2.



5.3.6. Interpretace výsledku testu FISH:



a) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru

jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a při použití

rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve

všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních

kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou

morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1

mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml

resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň 5 x

103 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za

pravděpodobně infikované Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než 5 x 103

typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za

negativní.



b) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového

filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí

a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus,

jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při

použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.



6. PCR test



PRINCIP



Použije-li se PCR test jako hlavní screeningový test a je pozitivní,

musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Pokud

se PCR test používá jako druhý screeningový test a je pozitivní, je pro

dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.



Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu

se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.



Poznámka:



Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné

zjištění 103 až 104 buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

na 1 ml přidaných do vzorku extraktů, které byly předtím testovány s

negativním výsledkem. Pro dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve

všech laboratořích mohou být vyžadovány optimalizační pokusy.



Používají se validovaná PCR činidla a protokoly. Přednostně se používá

metoda s interní kontrolou.



Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření, aby se zabránilo

kontaminaci vzorku cílovou DNA. PCR test by měli provádět zkušení

laboranti v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby

se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.



S negativními kontrolami (u průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy

zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k

přenosu DNA.



PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:



- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem,



- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterie a DNA ze vzorku,



- reakční směs PCR.



Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:



- alikvotní části resuspendovaných pelet, k nimž byl přidán Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus (příprava viz dodatek 2),



- suspenze 106 buněk na 1 ml Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 2140 nebo NCPPB

4053),



- pokud možno použít při provádění PCR testu také DNA extrahovanou z

pozitivních kontrolních vzorků.



Aby se zabránilo možné kontaminaci, připraví se pozitivní kontroly v

odděleném prostředí od vzorků, které budou testovány.



Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě

použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.



6.1 Metody purifikace DNA



Použijí se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky.



Připraví se kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorky.



K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici

různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymatických reakcí

a koncentrující cílovou DNA v extraktu vzorku.



Následující metoda byla optimalizována pro použití s validovanou

metodou PCR, uvedenou v dodatku 6.



6.1. a) Metoda podle Pastrika (2000)



1. Napipetuje se 220 µl lýzového pufru (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH

8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml.



2. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a umístí se do termobloku nebo

vodní lázně o teplotě 95 °C na dobu 10 minut.



3. Mikrozkumavka se vloží na 5 minut do ledu.



4. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lyzozymu (50 mg lyzozymu na 1 ml v

10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30

minut.



5. Přidá se 220 µl Easy DNA(R) roztok A (Invitrogen), dobře se promíchá

třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.



6. Přidá se 100 µl Easy DNA (R) roztok B (Invitrogen)a silně se

promíchá třepáním, až usazenina sama poteče do mikrozkumavky a vzorek

začne být stejnoměrně viskózní.



7. Přidá se 500 µl chloroformu a míchá se třepáním, až se viskozita

sníží a směs se stane homogenní.



8. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C pro oddělení

fází a vytvoření mezifáze.



9. Přenese se horní fáze do čisté mikrozkumavky.



10. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (-20 °C), krátce se promíchá třepáním a

inkubuje se na ledu po dobu 10 minut.



11. Odstředí se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C a odstraní se z

pelety etanol.



12. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (-20 °C) a promíchá převracením

mikrozkumavky.



13. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 10 minut při 4°C, peleta se

zachová a odstraní etanol.



14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA speed vac.



15. Peleta se resuspendujte v 100 µl sterilní vody (UPW) a nechá stát

nejméně 20 minut při pokojové teplotě.



16. Skladuje se při teplotě -20 °C až do upotřebení při PCR.



17. Jakákoliv bílá usazenina se odstraní odstředěním a pro PCR se

použije 5 µl supernatantu obsahujícího DNA.



6.1.b) Jiné metody



Jiné metody extrakce DNA by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že

jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících 103 až 104

patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.



6.2 PCR



6.2.1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle

validovaného protokolu (dodatek 6). Připraví se jeden desetinný roztok

vzorku DNA (1:10 ve sterilní vodě).



6.2.2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, kde

nehrozí kontaminace, podle zveřejněného protokolu (dodatek 6).

Validovaný protokol PCR je multiplexová reakce, která zahrnuje také

interní kontrolu PCR.



6.2.3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25

µl PCR reakce.



6.2.4. Zahrne se negativní kontrolní vzorek obsahující pouze reakční

směs PCR a přidá se stejná sterilní voda UPW, která byla použita do

směsi PCR namísto vzorku.



6.2.5. PCR mikrozkumavky se umístí do stejného termocykleru, který byl

použit při počátečním testování a provede se vhodně optimalizovaný

program PCR (dodatek 6)



6.3. Analýza produktu PCR



6.3.1. Rozdělí se amplikony PCR elektroforézou v agarózovém gelu.

Nanese se nejméně 12 µl amplifikované reakční směsi DNA z každého

vzorku smíchané s 3 µl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v)

agarózového gelu v Trisacetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V na

cm. Použije se vhodný marker DNA, např. 100 bp ladder.



6.3.2. Detekují se proužky DNA barvením v ethidium bromidu (0,5 mg na

l) po dobu 30-45 minut, za použití vhodných bezpečnostních opatření pro

zacházení s tímto mutagenem.



6.3.3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky, např. 302 nm) prosvíceném

gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a

výsledek se zdokumentuje.



6.3.4. U všech nových nálezů se zkontroluje pravost amplikonu PCR

provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku

amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a době s vhodným

restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Rozdělí se naštěpené

fragmenty elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se

charakteristický vzor restrikčního fragmentu pod UV prosvícením po

obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou

pozitivní kontrolou.



Interpretace výsledku PCR testu: PCR test je negativní, pokud amplikon

typický pro



Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti nebyl

zjištěn v daném vzorku, ale byl zjištěn ve všech pozitivních

kontrolních vzorcích (v případě vícenásobné PCR s rostlinnými interními

kontrolními primery: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být

amplifikován s daným vzorkem).



PCR test je pozitivní, pokud byl zjištěn amplikon typický pro

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti a

vzoru (pokud se požaduje), za předpokladu, že nebyl amplifikován žádným

z negativních kontrolních vzorků. Spolehlivého potvrzení pozitivního

výsledku lze dosáhnout také opakováním testu s druhou sadou PCR primerů

(oddíl 9.3).



Poznámka:



Lze mít podezření na inhibici PCR, pokud byl očekávaný amplikon získán

z pozitivního kontrolního vzorku obsahujícího Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus ve vodě, ale z pozitivní kontroly s Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus v bramborovém extraktu byly negativní.

Ve vícenásobných protokolech PCR s interními kontrolami PCR i inhibici

reakce došlo, pokud nebyl získán žádný z obou amplikonů.



Lze mít podezření na kontaminaci, pokud byl očekávaný amplikon získán z

jedné nebo více negativních zkoušek.



7. Test na lilku vejcoplodém



Poznámka:



Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné

zjištění 103 až 104 jednotek Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus tvořících kolonie na 1 ml přidaný k extraktům ze vzorku,

které byly testovány s negativním (příprava viz. dodatek 2)



Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě

připraveného extraktu ze vzorku a optimálních růstových podmínkách.

Metodu však lze úspěšně použít i na extrakty, které byly uchovávány v

glycerolu při teplotě -68 až -86 oC.



Některé odrůdy lilku vejcoplodého poskytují vynikající selektivní

obohacující médium pro růst Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus dokonce v případě nepřítomnosti příznaků a poskytují také

vynikající základní konfirmační test.



Pro omezení nebezpečí falešně negativních výsledků by měly být

vytvořeny optimální růstové podmínky.



Podrobnosti o pěstování jsou uvedeny v Dodatku 8.



7.1. Peleta podle 3.1.5. se rozdělí mezi rostliny lilku jednou z níže

uvedených metod (7.2, 7.3, 7.4). Používají se pouze rostliny ve fázi

2-3 listů do úplného rozvinutí třetího pravého listu. Aby se zajistilo

úplné využití resuspendované pelety i efektivní inokulaci, bude pro

níže uvedené postupy potřeba 15-25 lilků na vzorek.



7.2. Inokulace zářezem I



7.2.1. Každý květináč se horizontálně podepře (pro květináče o průměru

10 cm je vhodný blok pěnového polystyrénu s vyhloubenou částí o

rozměrech 5 cm hloubky, 10 cm šířky a 15 cm délky). Pro každý testovaný

vzorek se mezi stonek a blok umístí proužek sterilní hliníkové fólie.

Rostlinu je možno fixovat na místě gumovým páskem kolem bloku.



7.2.2. Pomocí skalpelu se provede mezi děložními lístky a prvním pravým

listem podélný nebo mírně úhlopříčný řez dlouhý 0,5 až 1,0 cm a hluboký

přibližně jako tři čtvrtiny průměru stonku.



7.2.3. Zářez se přidrží otevřený pomocí špičky čepele skalpelu a nanese

se do něj inokulum štětečkem na oční linky nebo jemným malířským

štětečkem namočeným do pelety. Zbytek pelety se rozdělí mezi všechny

testovací rostliny lilku.



7.2.4. Řez se překryje sterilní vazelínou aplikovanou injekční

stříkačkou o objemu 2 ml.



7.3 Inokulace zářezem II



7.3.1. Na stonek rostliny držené dvěma prsty se napipetuje mezi děložní

lístky a první pravý list kapka (přibližně 5 až 10 µl) suspendované

pelety.



7.3.2. Pomocí sterilního skalpelu se udělá sešikmený zářez (v úhlu

přibližně 5°), dlouhý 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 tloušťky

stonku, přičemž s řezem se začne v místě kapky suspendované pelety.



7.3.3. Řez se zakryje sterilní vazelínou z injekční stříkačky.



7.4. Inokulace injekční stříkačkou



7.4.1 Pro snížení vnitřního napětí buněk (turgoru) se rostliny lilku

den před inokulací nezalévají.



7.4.2 Stonky lilku vejcoplodého se inokulují těsně nad děložními lístky

pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23 G). Peleta

se rozdělí mezi testovací rostliny lilku vejcoplodého.



7.5. Jako pozitivní kontrola se inokuluje 5 rostlin stejnou inokulační

metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4) vodní suspenzí 105 až 106 buněk na 1 ml

známé kultury původce kroužkovitosti a kde je to možné i pletivem z

přirozeně infikovaných hlíz bramboru.



7.6. Jako negativní kontrola se inokuluje 5 rostlin sterilním 0,05 M

PBS stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4).



7.7. Po inokulaci se rostliny nechají inkubovat v karanténě ve vhodných

podmínkách (dodatek 8) po dobu až 4 týdnů při teplotě 18-24°C. Rostliny

se inkubují za dostatečného osvětlení a vysoké vlhkosti (70-80%) a

zalévají se tak, aby nedošlo k nasávání vody nebo vadnutí kvůli

nedostatku vody. Buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

odumírají při teplotách nad 30°C a optimální teplota je 21°C. Aby se

zamezilo kontaminaci, inkubují se rostliny pro pozitivní a negativní

kontroly ve skleníku nebo růstové komoře na jasně oddělených policích,

anebo při nedostatku místa se zajistí přísné oddělení mezi zacházení s

nimi. Pokud musí být rostliny pro různé vzorky inkubovány blízko sebe,

oddělí se vhodnými přepážkami. Při hnojení, zalévání, kontrole a jiné

manipulaci se věnuje maximální pozornost tomu, aby nedošlo ke

kontaminaci. Je nezbytné, aby skleníky i růstové komory byly chráněny

před veškerým hmyzem, protože by mohl přenášet bakterie z jednoho

vzorku na druhý.



7.8. Pravidelně po osmi dnech se spočítají rostliny vykazující

příznaky. Původce kroužkovitosti působí u lilku vejcoplodého vadnutí

listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost

(ztráta turgoru). Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo

strakaté, ale před znekrotizováním zesvětlí. Povadlá místa mezi

žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva

mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle

trvá období do objevení se příznaků, tím je větší naděje na přežití.

Rostliny mohou infekci odrůst. Mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou

mnohem citlivější vůči nízkým koncentracím původce kroužkovitosti než

starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů

a nebo krátce před ní. Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných

bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim

Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp.

atroseptica, Phoma exigua var. foveata, jakož i velké koncentrace

saprofytických bakterií. Tyto případy vadnutí lze odlišit od případů

způsobených původcem kroužkovitosti, jelikož rychle vadnou celé listy

nebo celé rostliny. Může se také připravit Gramovo barvení: tento test

rozliší Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus od Erwinia spp



7.9. Jakmile se na lilku vejcoplodém objeví příznaky, měla by být

provedena izolace za použití částí pletiva zvadlých listů nebo stonků

rostlin. Povrch listů a stonků lilku vejcoplodého se vydezinfikuje

otřením 70 % etanolem. Provede se test IF nebo PCR na šťávě z lilku a

izoluje se na vhodném (selektivním) médiu (viz oddíl 8). Může se také

připravit Gramovo barvení (dodatek 9). Čisté kultury podezřelé z

přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se

identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).



7.10. Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky

optimální, se může stát, že Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus zůstává v rostlinách lilku vejcoplodého jako latentní

infekce dokonce i po uplynutí inkubační doby až 4 týdnů. Pokud nejsou

po 4 týdnech pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR na

složeném vzorku částí stonků o délce 1 cm z každé testované rostliny

odebraných nad místem inokulace. Pokud je test pozitivní, měla by být

provedena izolace na vhodných (selektivních) médiích postupem podle

oddílu 8. Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se

patogenita (viz oddíl 9 a 10).



8. Izolace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus



Diagnóza může být potvrzena pouze tehdy, je-li původce kroužkovitosti

izolován a takto identifikován. Ačkoliv je původce kroužkovitosti

náročným organismem, je možno ho izolovat z pletiv projevujících

příznaky napadení.



Mohou jej však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto

se nedoporučuje provádět izolaci přímo z pelety pletiva hlízy (3.1.5)

nebo stonku (3.2). Přímá izolace Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus je možná za použití selektivního média a vhodného ředění

resuspendované pelety z pupkové části hlízy nebo ze stonků rostliny.



Izolace se provádí ze všech hlíz bramboru nebo částí stonku a z rostlin

lilku vejcoplodého, které nevykazují příznaky napadení, ale u nichž byl

pozitivní výsledek v testu IF/PCR složených vzorků (viz oddíl 7.9).

Pokud je třeba provést maceraci stonků lilku, měla by být provedena

podle oddílu 3.1.2.



Jako pozitivní kontroly se připraví desetinná ředění suspenze 106 cfu

na ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (např. NCPPB 4053

nebo PD 406). Aby se vyloučilo nebezpečí kontaminace, připraví se

pozitivní kontroly odděleně od vzorků, které mají být testovány.



Pro každou nově připravenou dávku selektivního média by se měla před

použitím k testování obvyklých vzorků přezkoušet jeho vhodnost pro růst

patogenu.



Kontrolní materiál se testuje stejným způsobem jako vzorky.



8.1. Roztěr na selektivní médium



8.1.1. Ze 100 µl alikvotní části ze vzorku resuspendované bramborové

pelety nebo šťávy z lilku vejcoplodého se připraví desetinásobné ředění

v peletovém pufru (dodatek 3).



8.1.2. Izolace z neředěné bramborové pelety se obvykle nepodaří kvůli

náročným růstovým podmínkám Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus a konkurenci saprofytů. Vzhledem k tomu, že bakterie je

obvykle v infikovaných pletivech přítomná ve vysokých koncentracích,

lze saprofyty obvykle vypláchnout ředěním, zatímco patogen zůstává.

Proto se doporučuje rozetřít 100 µl z každého vzorku, v ředění1/100 až

1/10 000 na MTNA médium nebo NCP- 88 médium (dodatek 5), za použití

pomůcek určených k roztěrům (hokejek) a techniky roztěrů.



8.1.3. Desky se inkubují v temnu při teplotě 21-23°C.



8.1.4. Počáteční kontrola misek zahrnuje porovnání s kontrolními

miskami a počítání všech kolonií podobných Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus se provádějí po třech dnech, s dalším počítáním po

5,7 a 10 dnech.



8.2. Čištění podezřelých kolonií



Poznámka:



Subkultury kolonií podobných Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus pro inokulaci lilku vejcoplodého a/nebo následnou

identifikaci by se měly pěstovat na YGM médiu; inokulace a identifikace

by se měly provést dříve, než jsou média příliš přerostlá, tj. nejlépe

po 3-5 dnech.



8.2.1. Kolonie podobné Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se

rozetřou na jedno z následujících médií (složení uvedena v dodatku 5):



- živný dextrózový agar (pouze pro subkultury),



- kvasničný pepton glukosový agar,



- agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi.



Inkubace probíhá při teplotě 21-24 °C po dobu maximálně 10 dní.



Původce kroužkovitosti roste pomalu a obvykle vytváří kolonie velikosti

špendlíkové hlavičky, vyklenuté, smetanově zbarvené.



8.2.2. Opětovně se provede roztěr pro zaručení čistoty. U subkultur se

rychlost růstu zlepšuje. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy

slonoviny, někdy žluté, okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté,

slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1 – 3 mm.



Jednoduché Gramovo barvení (dodatek 9) může pomoci vybrat kolonie pro

další testování.



8.2.3 Podezřelé kultury se identifikují (viz oddíl 9) a provede se

zkouška patogenity (viz oddíl 10).



9. Identifikace



Čisté kultury pravděpodobné izolované kultury Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus se identifikují za použití nejméně dvou

následujících testů založených na různých biologických principech. V

případě potřeby se zahrne pro každý provedený test známý referenční

kmen.



9.1. Nutriční a enzymatické identifikační testy



Zjišťují se následující fenotypické vlastnosti. Veškerá média by se

měla inkubovat při 21 °C a po šesti dnech by měla být vyhodnocena.

Pokud nedošlo k žádnému růstu, inkubuje se po dobu nejvýše 20 dní.



Všechny testy musí zahrnovat kontrolu se známým kmenem Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus. Nutriční a fyziologické testy se musí

provádět za použití inokula ze subkultur živného agaru. Morfologická

srovnání se musí provádět z kultur z živného dextrózového agaru.



Test Očekávaný výsledek

Oxidačně-fermentační (O/F) inertní nebo slabě

oxidační



Aktivita oxidázy -

Aktivita katalázy +

Redukce nitrátů -

Aktivita ureázy -

Tvorba H2S -

Tvorba indolu -

Využívání citrátu -

Hydrolýza škrobu - nebo slabá

Růst při 37 °C -

Růst v 7% NaCl -

Hydrolýza želatiny -

Hydrolýza eskulinu +

Tvorba kyseliny z:

- glycerolu -

- laktózy - nebo slabá

- rhamnózy -

- salicinu -

Gramovo barvení (dodatek 9)



9.2. IF test



a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk/ml v pufru na IF (dodatek

3).



b) Připraví se série dvojnásobného ředění vhodného antiséra.



c) Provede se IF postup (oddíl 4).



d) Pozitivního výsledku IF testu je dosaženo, jestliže IF titr kultury

odpovídá titru pozitivní kontroly.



9.3. PCR test



a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na ml ve sterilní vodě

(UPW)



b) Zahřívá se 100 µl suspenze buněk v uzavřených mikrozkumavkách v

ohřívacím bloku nebo vřící vodní lázni při teplotě 100 °C po dobu 4

minut. V případě potřeby se může lýza buněk podpořit přidáním čerstvě

připraveného NaOH do konečné koncentrace 0,05 M. Vzorky lze potom

uložit při teplotě -16 až -24 °C až do použití.



c) Pro amplifikaci Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

specifických amplikonů se použijí vhodné postupy PCR (např. Pastrik,

2000; viz dodatek 4; Li a de Boer, 1995; Mills a kol., 1997; Pastrik a

Rainey, 1999; Schaad a kol., 1999).



d) Identifikace Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus je

pozitivní, pokud jsou amplikony PCR stejné velikosti a mají stejnou

mnohotvárnost délky fragmentu jako pozitivní kontrolní kmen.



9.4. FISH test



a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na ml v UPW.



b) Provede se postup FISH (oddíl 5)



c) Test FISH je pozitivní, jsou-li dosaženy stejné reakce kultury a

pozitivní kontroly.



9.5. Analýza mastných kyselin (FAP)



a) Kultura se pěstuje na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) po dobu 72

hodin při teplotě 21 °C (+/- 1°C).



b) Použije se vhodný postup FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).



c) Test FAP je pozitivní, pokud je profil podezřelé kultury identický s

profilem pozitivní kontroly. Přítomnost charakteristických mastných

kyselin 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 a 17:0

Anteiso jasně svědčí o přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus. Jiné rody jako Curtobacterium, Arthrobacter a Micrococcus

také obsahují některé z těchto kyselin, ale 15:1 Anteiso A je pro tyto

bakterie neobvyklá kyselina, která se však vyskytuje ve všech

Clavibacter spp. v rozmezí 1-5 %. U Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus se hodnota obvykle pohybuje kolem 5 %.



9.6. BOX-PCR



a) Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na ml v UPW.



b) Provede se test postupem podle Smith a kol., 2001.



10. Test patogenity



Pro konečné potvrzení původce kroužkovitosti a pro stanovení virulence

kultur identifikovaných jako Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus musí být provedena zkouška patogenity.



10.1. Připraví se inokulum přibližně 106 buněk na ml z 3- denních

kultur testované izolované látky a vhodného pozitivního kmene

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.



10.2. Naočkuje se 5-10 stonků mladých semenáčků lilku vejcoplodého ve

fázi 3 pravých listů.



10.3. Inkubuje se při teplotě 18-24 °C při dostatečném světle a vysoké

relativní vlhkosti s přiměřeným zaléváním, aby nedošlo k přemokření

nebo vyschnutí. U čistých kultur by mělo během 2 týdnů nastat typické

vadnutí, avšak rostliny, které po uplynutí této doby nevykazují žádné

příznaky infekce, by se měly inkubovat až 3 týdny při teplotách

příznivých pro růst lilku vejcoplodého, ale nepřesahujících 25 °C.

Jestliže se po 3 týdnech příznaky infekce nevyskytují, nemůže být

kultura považována za patogenní formu Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus.



10.4. Izolace se provádí z rostlin s příznaky infekce odstraněním části

stonku 2 cm nad místem inokulace. Pletiva se rozdrtí a suspendují v

malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru.

Izoluje se ze suspenze rozetřením nebo nanesením na MTNA a YPGA,

inkubuje se po dobu 3-5 dní při teplotě 21-23°C a sleduje se vznik

kolonií typických pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.



Dodatek 1



Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů



------------------------------------------------------ -------------------------------------------

Laboratoř (1) Místo Země

------------------------------------------------------ -------------------------------------------

Agentur für Gesundheit und Vídeň a Linec Rakousko

Ernährungssicherheit



Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgie



Plantedirektoratet Lyngby Dánsko



Central Science Laboratory York Anglie



Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Skotsko



Laboratoire National de la Protection Angers Francie



Végétaux, Unité de Bactériologie



Laboratoire National de la Protection Le Rheu Francie



Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme

de Terre



Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Německo



Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Německo



State Laboratory Dublin Irsko



Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nizozemsko



Norwegian Crop Research Institute, Plant Aas Norsko



Protection Centre



Direcçăo-General de Protecçăo das Culturas Lisabon Portugalsko



Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slovinsko



Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca Španělsko

------------------------------------------------------ -------------------------------------------



(1) Kontaktní osoby: viz internetová stránka

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main



Dodatek 2



Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy

PCR/IF a FISH



Vypěstuje se 72 hodinová kultura virulentního kmene C. m. subsp.

sepedonicus (NCPPB 4053 nebo PD 406) na základním médiu MTNA a

suspenduje se v 10 mMfosfátového pufru pro získání hustoty přibližně 1

až 2 x 108 buněk schopných tvorby kolonií/ml. Toho se obvykle dosáhne

prostřednictvím slabě zakalené suspenze odpovídající optické hustotě

0,20 – 600 nm. Výkrojky pletiva se odeberou z pupkových konců 200 hlíz

odebraných z produkce odrůdy s bílou slupkou, u které je jisté, že je

prosta C. m. subsp. sepedonicus.



Pupkové výkrojky se zpracují obvyklým způsobem a resuspenduje se peleta

v 10 ml.



Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 mikrol

resuspendované pelety.



Přenese se 100 ěl suspenze C. m. subsp. sepedonicus do první

mikrozkumavky. Nechá se protřepat.



V následujících pěti mikrozkumavkách se provedou desetinná ředění.



Šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako pozitivní kontrola.

Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako negativní kontroly.

Mikrozkumavky se opatří štítkem.



Připraví se alikvotní části z 100 mikrol ve sterilních mikrozkumavkách

o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku.

Skladování probíhá při teplotě – 16 až – 24 °C až do doby použití.



Přítomnost a množství C. m. subsp. sepedonicus v kontrolních vzorcích

by měla být nejprve potvrzena prostřednictvím imunofluorescence.



Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních

kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.



Pro IF a FISH testy se provedou kvantitativní rozbory pozitivních a

negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.



Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být C. m. subsp.

sepedonicus zjištěn v nejméně v 106 a 104 buněk/ml pozitivních kontrol

a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.



Dodatek 3



Pufry pro testovací postupy



OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho

roku.



1. Pufry pro extrakci



1.1.Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)



Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání

homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý) 4,26 g

KH2PO4 2,72 g

Destilovaná voda 1,00 l



Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v

autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.



Užitečné mohou být následující složky:



Účel Množství (na

litr)

Lubrolové vločky Protisrážlivý prostředek (*) 0,5 g

DC silikonový odpěňovač Odpěňovací činidlo (*) 1,0 ml

Tetrasodiumpyrofosfát Antioxidační činidlo 1,0 g

Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP – 40) Vázání inhibitorů PCR 50 g

-------------------------------------------

(*) pro použití při extrakci homogenizací





1.2.Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)



Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z

pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním

koncentrovány do pelety.



Na2HPO4 .12H2O 2,7 g

NaH2PO4 . 2H2O 0,4 g

Destilovaná voda 1,00 l



Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v

autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.



2. Pufry pro IF test



2.1. Pufry pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS),

pH 7,2)



Tento pufr se používá k ředění protilátek.



Na2HPO4 .12H2O 2,7 g

NaH2PO4 . 2H2O 0,4 g

NaCl 8,0 g

Destilovaná voda 1,00 l





Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a provede se sterilizace v

autoklávu při 121 °C po dobu 15 min



2.2. IF-pufr-Tween



Tento pufr se používá k mytí sklíček. Přidá se 0,1 % Tween 20 k pufru

pro IF.



2.3. Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6



Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k

zvýšení fluorescence.

Na2HPO4 .12H2O 3,2 g

NaH2PO4 . 2H2O 0.15 g

Glycerol 50 ml

Destilovaná voda 100 ml



Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield (R) (Vector

Laboratories) nebo Citifluor® (Leica).



Dodatek 4



Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk



1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom

pozorovacím poli (c).



2. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku

mikroskopického sklíčka (C).



C = c x S/s,



kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více jamkami a



s = plocha pole objektivu.



s = đi2/4G2K 2,



kde i = koeficient pole (v rozmezí od 8 – 24 podle typu okuláru),



K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),



G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).



3. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml

resuspendované pelety (N).



N = C x 1 000/y x F,



kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a



F = zřeďovací faktor resuspendované pelety



Dodatek 5



Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus



1. Obecná růstová média



Živný agar (Nutrient agar = NA)

Živný agar (Difco) 23 g

Destilovaná voda 1,00 l







Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po

dobu 15 min.



Živný dextrózový agar (Nutrient dextrose agar = NDA)



Difco bakto živný agar obsahující 1 % D(+) glukózy (monohydrátu).

Provede se sterilizace v autoklávu při 121 C po dobu 20 min.



Kvasnično-pepton-glukózový agar (Yeast peptone glucose agar = YPGA)

Kvasnicový extrakt (Difco) 5,0 g

Baktopepton (Difco) 5,0 g

D(+) glukóza (monohydrát) 10,0 g

Baktoagar (Difco) 15,0 g

Destilovaná voda 1,00 l





Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po

dobu 15 min.



Médium s kvasnicovým extraktem a minerálními solemi (Yeast extract

mineral salts medium = YGM)

Kvasnicový extrakt 2,0 g

(Difco)

D(+) glukóza 2,5 g

(monohydrát)

K2HPO4 0,25 g

KH2PO4 0,25 g

MgSO4 . 7H2O 0,1 g

MnSO4 . H2O 0,015 g

NaCl 0,05 g

FeSO4 . 7H2O 0,005 g

Baktoagar (Difco) 18,0 g

Destilovaná voda 1,00 l





Složky se rozpustí a provede se sterilizace 0,5 l média v autoklávu při

115 °C po dobu 20 min.



b) Validovaná selektivní růstová média



Médium MTNA



Pokud není uvedeno jinak, pocházejí všechny složky médií z BDH.

Kvasnicový extrakt 2,0 g

(Difco)

Manit 2,5 g

K2HPO4 0,25 g

KH2PO4 0,25 g

MgSO4 . 7H2O 0,1 g

MnSO4 . H2O 0,015 g

NaCl 0,05 g

FeSO4 . 7H2O 0,005 g

Agar (Oxoid č. 1) 16,0 g

Destilovaná voda 1,00 l



Složky se rozpustí, pH se upraví na 7,2. Po autoklávování (při 121 °C

po dobu 15 min.) a ochlazení na 50 st. C se přidají antibiotika:

trimethoprim 0,06 g, nalidixic acid 0,002 g, amphotericin B 0,01 g.



V zásobě se nechají roztoky antibiotik: trimethoprim (Sigma) a

nalidixic acid (Sigma) (obě 5 mg/ml) v 96 % metanolu, amphotericin B

(Sigma) (1 mg/ml) v dimethyl sulfoxidu. Zásobní roztoky jsou

sterilizované filtrací.



Poznámka:



Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je

trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 st. C.

Médium NCP-88

Živný agar (Difco) 23,0 g

Kvasnicový extrakt 2,0 g

(Difco)

D-manit 5,0 g

K2HPO4 2,0 g

KH2PO4 0,5 g

MgSO4 . 7H2O 0,25 g

Destilovaná voda 1,00 l



Složky se rozpustí,upraví se pH na 7,2. Po autoklávování a ochlazení na

50 °C se přidají následující antibiotika: polymyxin B sulphate (Sigma)

0,003g, nalidixic acid (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g.



Antibiotika se rozpustí pro přípravu zásobních roztoků následovně:

nalidixic acid v 0,01 M NaOH, cykloheximid v 50% etanolu, polymyxin B

sulphate v destilované vodě. Zásobní roztoky se sterilizují filtrací.



Poznámka:



Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je

trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 st. C.



Dodatek 6



Validované protokoly a činidla pro PCR



Poznámka:



Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 103

až 104 buněk C. m. subsp. sepedonicus na 1 ml vzorkového extraktu.

Úvodní testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní

výsledky se skupinou vybraných kmenů bakterií.



1. Vícenásobný PCR protokol s interní PCR kontrolou (Pastrik, 2000)



1.1. Oligonukleotidní primery

primer PSA-1 5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'

primer PSA-R 5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'

primer NS-7-F 5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'

primer NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’





Předpokládaná velikost amplikonu z DNA C. m. subsp. sepedonicus šablony

= 502 bp (sada PSA-primerů).



Předpokládaná velikost amplikonu z interní PCR kontroly 18S rRNA = 377

bp (sada NS- primerů).



1.2. Reakční směs PCR



------------------------------------- ------------------------- ------------------------

Činidlo Množství na reakci Konečná koncentrace

------------------------------------- ------------------------- ------------------------

Sterilní voda (UPW) 15,725 µl

10x PCR pufr (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakce V) (10 %) 0,25 µl 0,1 %

Směs d-nTP (20 mM) 0,125 µl 0,1 mM

Primer PSA-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM

Primer PSA-R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM

Primer NS-7-F (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM

Primer NS-8-R (10 µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM

Taq polymeráza (5 U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U

Vzorkové množství 5,0 µl

------------------------------------- ------------------------- ------------------------

Celkový objem 25,0 µl

------------------------------------- ------------------------- ------------------------





(1) Metody byly validovány za použití Taq polymerázy Perkin Elmer

(AmpliTaq nebo Gold) a Gibco BRL.



(2) Koncentrace primerů NS-7 F a NS-8-R byla optimalizována pro

extrakci pupkové části bramboru za použití homogenizační metody a

purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz oddíl 6.1 písm. a) a 6.2).

Při použití extrakce třepáním nebo jinými metodami izolace DNA je nutná

nová optimalizace koncentrací činidla.



1.3. Reakční podmínky pro PCR



Postupuje se podle následujícího programu:

1 cyklus: i) 3 minuty při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)



10 cyklů ii) 1 minuta při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)

iii) 1 minuta při teplotě 64 °C (připojení primerů)

iv) 1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)



25 cyklů v) 30 sekund při teplotě 95 °C (denaturace DNA matrice)

vi) 30 sekund při teplotě 62 °C (připojení primerů)

vii) 1 minuta při teplotě 72 °C (prodlužování kopie)



1 cyklus viii) 5 minut při teplotě 72 °C (závěrečná prodlužování)

ix) Udržuje se při teplotě 4 °C





Poznámka:



Tento program je optimalizován pro použití s tepelným cyklerem MJ

Research PTC 200. Při použití jiných modelů může být nutná modifikace

kroků cyklů ii), iii) iv), v), vi) a vii).



1.4. Analýzy ampliconu restriktivním enzymem



Produkty PCR amplifikované z DNA C. m. subsp. sepedonicus produkují

charakteristickou mnohotvárnost délky fragmentu s enzymem Bgl II po

inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Fragmenty získané z

fragmentu specifického pro C. m. subsp. sepedonicus mají rozměry 282 bp

a 220 bp.



2. Příprava nanášecího pufru



2.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Bromfenolová modř 5 g

Destilovaná voda 50 ml





Nanášecí pufr



Glycerol (86 %) 3,5 ml

Bromfenolová modř 300 µl

Destilovaná voda 6,2 ml





3. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0



TRIS 48,4 g

Ledová kyselina octová 11,42 ml

EDTA (sodná sůl) 3,72 g

Destilovaná voda 1,00 l



Před použitím se zředí na 1x.



Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).



Dodatek 7



Validovaná činidla pro FISH test



1. Oligosondy



Sonda specifická pro Cms CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’

Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’





2. Fixační roztok



[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ!

POUŽÍVAT RUKAVICE A NEVDECHOVAT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]



i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water =

(UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu.

Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání

magnetickým míchadlem.



ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH

7,0) a 5 kapek HCl 1N. Indikačním proužkem se zkontroluje pH a v

případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH.



[UPOZORNĚNÍ: V ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ pH!]



iii) Roztok se přefiltrujte přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se

chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.



iv) Poznámka:



Alternativní fixační roztok: 96 % etanol

.



3. 3x Hybmix

NaCl 2,7 M

Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterilizovaný přes filtr a 15 mM

autoklávovaný)



Zředí se až 1x, podle potřeby.



4. Hybridizační roztok

1x Hybmix

Sodium dodecyl sulfát (SDS) 0,01 %

Sonda EUB 338 5 ng/mikrol

Sonda CMSCY301 5 ng/mikrol



Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce.

Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 mikrol

hybridizačního roztoku.



Tabulka: Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

------------------------------------- -------------------------

2 sklíčka 8 sklíček

------------------------------------- -------------------------

Sterilní ultra čistá voda 50,1 200,4

3x hybmix 30,0 120,0

1 % SDS 0,9 3,6

sonda EUB 338 (100 ng/mikrol) 4,5 18,0

sonda CMSCY301 (100 ng/mikrol) 4,5 18,0

------------------------------------- -------------------------

Celkový objem (mikrol) 90,0 360,0

------------------------------------- -------------------------



Poznámka.:



Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v

temnu při teplotě – 20 °C. Během použití je nutné je ochraňovat před

přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.



5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0



Na2HPO4 8,52 g

KH2 PO4 5,44 g

Destilovaná voda 1,001



Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a sterilizuje se autoklávováním

při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Dodatek 8



Pěstování lilku vejcoplodého



Semena lilku vejcoplodého (Solanum melongena) se vysejí do

pasterizovaného výsevního substrátu. Semenáčky s plně rozvinutými

děložními lístky (10 až 14 dní) se přepichují do pasterizovaného

pěstebního substrátu.



Lilek by se měl pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

Délka dne: 14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;

Teplota: den: 21 až 24 °C,

noc: 15 °C.





Vhodné odrůdy lilku vejcoplodého



„Black Beauty“,



„Long Tom“,



„Rima“,



„Balsas“.



Dodavatel: viz internetová stránka



http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main



Dodatek 9



Gramovo barvení v Huckerově modifikaci (Doetsch, 1981)^(1)



Roztok krystalové violeti



Rozpustí se 2 g krystalové violeti v 20 ml 95 % etanolu.



Rozpustí se 0,8 g šťavelanu amonného v 80 ml destilované vody. Oba

roztoky se smíchají.

Lugolův jódový roztok

Jód 1 g

Jodid draselný 2 g

Destilovaná voda 300 ml



Pevné látky se společně rozetřou pomocí tloučku v misce. Nasypou se do

vody a míchají se v uzavřené nádobě do rozpuštění.



Safraninový roztok kontrastního barviva

Zásobní roztok:

Safranin O 2,5 g

95 % etanol 100 ml



Zamíchá se a uloží se.



Ředění: 1:10 pro přípravu pracovního roztoku.



Postup barvení



1. Připraví se roztěry, vysuší se na vzduchu a fixují se zahřátím.



2. Sklíčko se zalije roztokem krystalové violeti a nechá se působit 1

minutu.



3. Krátce se omyje pod tekoucí vodou.



4. Zalije se Lugolovým jódovým roztokem a nechá se působit po dobu

jedné minuty.



5. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.



6. Odbarvuje se pomocí po kapkách přidávaného 95 % etanolu tak dlouho,

pokud se vyplavuje barvivo, nebo ponořením za jemného pohybování do

etanolu na dobu 30 sekund.



7. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.



8. Zalije se safraninovým roztokem a nechá se působit 10 s.



9. Opláchne se pod tekoucí vodou a vysuší se savým papírem.



Grampozitivní bakterie se zbarví fialově modře, gramnegativní bakterie

se zbarví růžovočerveně.



(1) Mohou se také použít komerčně dostupné roztoky nebo barvicí

soupravy.



LITERATURA



1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring

rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers.

Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11 288 EN,

21 pp.



2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria

from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213–218.



3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of

Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14

(2), 147–152.



4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. V:

Manual of methods for general bacteriology, American Society for

Microbiology, Washington, 21–23.



5. Hugh, R. a Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of

fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various

gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24–26.



6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of

Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fattyacid analysis.

Systematic and Applied Microbiology 14; 335–345.



7. Janse, J. D. a J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC

method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium

sepedonicum) in potato. EPPO Bull., č. 17, 1987, pp. 1–10.



8. Jansing, H. a K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and development of a

semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105,

590–601.



9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the

oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.



10. Klement Z.; Rudolph, K a D. C. Sands, 1990. Methods in

Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.



11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J.

appl. Bact., 29, 114–118.



12. Lelliott, R. A., E. Billing a A. C. Hayward, 1966. A determinative

scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl.

Bact., 29, 470–489.



13. Lelliott, R. A. a P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring

rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.)

in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101–106.



14. Li, X. a S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction

primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Phytopathology, 85,

837–842.



15. Mills, D., Russell, B., W. a J., W. Hanus, 1997. Specific detection

of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by amplification of

three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization.

Phytopathology, 87, 8, 853–861.



16. Pastrik, K. -H. a R.A. Rainey. 1999. Identification and

differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase

chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687–693.



17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis subsp.

sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of

host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155–165.



18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive

phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria.

Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.



19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. a Knorr, D. (1999)

Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato

tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection

system. Plant Disease 83; 1095–1100.



20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant

pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. – 3. ed.; St. Paul, Minnesota:,

373 pp.



21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the

genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.



22. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive

sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum

primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology,

107 (7), 739–748.



23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test

reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working

party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481–527.



24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other

Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International

Journal of Systematic Bacteriology 42; 281–295.



25. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. a A. D. L.

Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes

brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s

rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546–4554.



B. METODY DIAGNóZY, DETEKCE A IDENTIFIKACE PůVODCE HNěDé HNILOBY



Předložené postupové diagramy popisují různé postupy, které jsou

součástí:



i) diagnózy hnědé hniloby v hlízách bramboru a bakteriálního vadnutí

bramboru, rajčete a některých dalších hostitelských rostlin,



ii) detekce Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru, rostlin

bramboru, rostlin rajčete a jiných hostitelských rostlin, a ve vzorcích

vody a půdy,



iii) identifikace Ralstonia solanacearum (R. solanacearum)



OBECNÉ ZÁSADY



Optimalizované protokoly pro různé metody, schválená činidla a

podrobnosti pro přípravu testovaných a kontrolních materiálů jsou

uvedeny v dodatcích. Seznam laboratoří, které se podílely na

optimalizaci a validaci protokolů, je v dodatku 1.



Protože protokoly obsahují zjištění karanténního organismu a zahrnují

použití životaschopných kultur R. solanacearum jako kontrolních

materiálů, je nutné pracovat za vhodných karanténních podmínek s

odpovídajícím zařízením na odstraňování odpadů a za podmínek

stanovených příslušným povolením rostlinolékařské správy.



Testovací parametry musí zajišťovat stálé a reprodukovatelné zjištění

úrovní R. solanacearum jako stanovené prahy vybraných metod.



Zcela nezbytná je přesná příprava pozitivních kontrol.



Testování podle požadovaných prahů také zahrnuje správné nastavení,

údržbu a kalibraci zařízení, pečlivé zacházení s činidly a jejich

uchovávání a všechna opatření pro zamezení kontaminace mezi vzorky,

např. oddělení pozitivních kontrol od testovaných vzorků. Musí být

uplatněno standardní řízení kvality, aby se zabránilo administrativním

a jiným chybám, zvláště při označování a v dokumentaci.



Podezření z výskytu, jak je uvedeno v § 4 odst. 1, naznačuje pozitivní

výsledek z diagnostických nebo screeningových testů provedených na

vzorku, jak je znázorněno v níže uvedených postupových diagramech.

První pozitivní screeningový test ( test IF, PCR/FISH, selektivní

izolace) musí být potvrzen druhým screeningovým testem založeném na

jiném biologickém principu.



Pokud je první screeningový test pozitivní, existuje podezření na

infekci R. solanacearum a musí být proveden druhý screeningový test.

Pokud je i druhý screeningový test pozitivní, pak je podezření

potvrzeno a musí se pokračovat v testování podle daného schématu.

Jestliže je druhý screeningový test negativní, pak vzorek není

považován za infikovaný R. solanacearum.



Potvrzená přítomnost podle §. 5 odst. 1 vyžaduje izolaci a identifikaci

čisté kultury R. solanacearum s potvrzením patogenity.



1. Použití postupových diagramů



1.1. Postupový diagram pro diagnózu hnědé hniloby a bakteriálního

vadnutí (Ralstonia solanacearum) hlíz bramboru a rostlin bramboru,

rajčete a jiných hostitelských rostlin vykazujících příznaky hnědé

hniloby nebo bakteriálního vadnutí



Postup testování je určen pro hlízy a rostliny bramboru s podezřením z

výskytu nebo typickými příznaky hnědé hniloby nebo bakteriálního

vadnutí. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci patogena z

infikovaného vodivého pletiva na selektivní živné půdě a v případě

pozitivního výsledku identifikaci kultury Ralstonia solanacearum.



-----



1) Popis příznaků se nachází v oddíle 2.1.



2) Rychlé diagnostické testy usnadňují předběžnou diagnózu, ale nejsou

dokonalé. Negativní výsledek naznačuje vždy nepřítomnost patogenu.



3) Test na výtok slizu ze svazků cévních stonku je popsán v oddíle

6.1.1.



4) Test na přítomnost granulí poly-beta-hydroxybutyrátu je popsán v

oddíle 6.1.2.



5) Sérologické aglutinační testy bakteriálního slizu nebo extraktů z

pletiva vykazujícího příznaky jsou popsány v oddíle 6.1.3.



6) Test IF bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech

pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.5.



7) Test FISH bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech

pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.7.



8) Test ELISA bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo

extraktech pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.8.



9) Test PCR bakteriálního slizu suspendovaného ve vodě nebo extraktech

pletiva vykazujícího příznaky je popsán v oddíle 6.1.6.



10) Patogen je obvykle snadno izolovatelný z rostlinného materiálu

vykazujícího příznaky metodou zřeďovacích roztěrů (postupným ředěním)

(viz. v oddíle 2.3.).



11) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.



12) Kultivace může selhat při pokročilých fázích infekce z důvodů

konkurence nebo bujného růstu saprofytických bakterií. Jestliže jsou

příznaky infekce typické, ale izolační test je negativní, musí se

izolace opakovat, nejlépe kultivací na selektivních živných půdách.



13) Spolehlivá identifikace čistých kultur R. solanacearum se provede

pomocí testů popsaných v bodu 6.2. Dílčí specifická charakteristika je

nepovinná, ale doporučuje se pro každý nový případ.



14) Test patogenity je popsán v bodu 6.3.



1.2. Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia

solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru nevykazujících příznaky



Testování je určeno ke zjištění latentních infekcí v hlízách bramboru.

Pozitivní výsledek alespoň ze dvou screeningových testů (viz poznámka v

diagramu 3), z nichž každý je založen na jiném biologickém principu,

musí být doplněn izolací patogenu a dále, v případě izolace typických

kolonií, potvrzením, že čistá kultura je R. solanacearum. Pozitivní

výsledek pouze z jednoho screeningového testu není dostačující k tomu,

aby byl vzorek považován za podezřelý. Screeningové testy a izolační

testy musí umožnit detekční práh 103 až 104 buněk/ml resuspendované

pelety zahrnutý jako pozitivní kontroly v každé sérii testů.



-----



1) Standardní velikost vzorku je 200 hlíz, ačkoli postup lze použit i

na menší počet, jestliže 200 hlíz není k dispozici.



2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.1.1.



3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických

principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede

se nejméně jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek

považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, je pro

validaci prvního pozitivního výsledku nezbytný ještě jeden nebo více

screeningových testů založených na různých biologických principech.

Je-li druhý nebo další test negativní, je vzorek považován za

negativní. Další testy nejsou nutné.



4) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.



5) Test selektivní izolace je popsán v oddíle 6.1.4.



6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.



7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.



8) Testy ELISA jsou posány v oddíle 6.1.8.



9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.



10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.



11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo

inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech

získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, je třeba

opakovat izolační testy ze stejné pelety nebo dodatečným odebráním

vodivého pletiva z blízkosti pupkového konce hlíz stejného vzorku,

případně provést test s dalšími vzorky.



12) Spolehlivé identifikace čistých kultur podezřelých na R.

solanacearum se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.



13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.



Postupový diagram pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum ve

vzorcích rostlin bramboru nevykazujících příznaky, rostlin rajčete

nevykazujících příznaky nebo rostlin jiných hostitelských rostlin

nevykazujících příznaky



-----



1) Viz. oddíl 3.2.1., kde jsou uvedeny doporučené velikosti vzorků.



2) Metody extrakce a koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 3.2.1.



3) Pokud jsou alespoň dva testy založené na různých biologických

principech pozitivní, musí být provedena izolace a potvrzení. Provede

se alespoň jeden screeningový test. Je-li test negativní, je vzorek

považován za negativní. V případě, že je test pozitivní, vyžaduje se

pro validaci prvního pozitivního výsledku provedení druhého nebo více

screeningových testů založených na různých biologických principech.

Jsou-li druhý nebo další testy negativní, považuje se vzorek za

negativní. Další testy nejsou nutné.



4) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.



5) Test IF je popsán v oddíle 6.1.5.



6) Testy PCR jsou popsány v oddíle 6.1.6.



7) Test FISH je popsán v oddíle 6.1.7.



8) Testy ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.8.



9) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.



10) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.



11) Kultivace nebo biotest mohou selhat z důvodů konkurence nebo

inhibice saprofytickými bakteriemi. Jsou-li ve screeningových testech

získány pozitivní výsledky, ale izolační testy jsou negativní, opakují

se izolační testy.



12) Spolehlivé identifikace čistých kultur, u kterých je podezření, že

se jedná o R. solanacearum, se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle

6.2.



13) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.



2. Diagnóza původce hnědé hniloby



2.1. Příznaky



2.1.1. Příznaky u bramboru



Rostlina bramboru.

Raná fáze infekce v polních podmínkách se rozpozná vadnutím listů

směrem k vrcholu rostliny při vysokých teplotách během dne, přičemž v

noci dochází k zotavení. V raných fázích vadnutí zůstávají listy

zelené, ale později žloutnou a objevují se hnědé nekrózy. Dochází také

k ohýbání listů dolů. Vadnutí jednoho výhonku nebo celé rostliny se

rychle stává nevratným a končí kolapsem a uhynutím rostliny. Z cévních

svazků napříč uříznutých stonků zvadlých rostlin obvykle vytéká hnědý a

mléčný bakteriální sliz nebo je možné sliz vymáčknout. Při ponoření

uříznutého stonku svisle do vody se z cévních svazků táhnou vlákna

slizu.



Hlíza bramboru. Hlízy bramboru je třeba překrojit napříč u pupkového

konce a podélně přes pupkový konec. V rané fázi se infekce pozná podle

láhvově žlutého až světle hnědého zabarvení cévního prstence, ze

kterého po několika minutách začne prýštit bledý krémový bakteriální

sliz. Později se cévní zbarvení stává výrazněji hnědým a odumření se

může rozšířit do parenchymatického pletiva. V pokročilejších fázích se

infekce rozšíří vně od pupkového konce hlízy a z oček může vytékat

bakteriální sliz, na který se přilepují částice půdy. Na slupce se

mohou objevit červenohnědá, lehce propadlá místa jako důsledek

vnitřního kolapsu cévního pletiva. V pokročilejších fázích infekce je

obvyklý sekundární rozvoj měkkých hnilob bakteriálního a houbového

původu.



2.1.2. Příznaky u rajčete



Rostlina rajčete. Prvním viditelným příznakem je povadlý vzhled

nejmladších listů. Za příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy

kolem 25 st. C, při nasycené vzdušné vlhkosti) se během několika málo

dní rozvine kroucení listů směrem dolů a vadnutí na jedné straně

rostliny nebo celé rostliny, které končí jejím úplným odumřením. Za

méně příznivých podmínek pro patogena (teplota půdy méně než 21şC)

rostlina tolik nevadne, ale na stonku se může tvořit větší počet

postranních výhonů. Je možné pozorovat vodou nasáklé pruhy od spodu

stonku, které jsou dokladem odumírání cévního systému. Při příčném řezu

stonkem vylučují hnědě zbarvená vodivá pletiva bílý nebo nažloutlý

bakteriální sliz.



2.1.3. Příznaky u jiných hostitelů



Rostliny Solanum dulcamara a S. nigrum. Za normálních podmínek jsou u

těchto plevelných hostitelských rostlin zřídkakdy pozorovány příznaky

vadnutí, pokud teploty půdy nepřevyšují 25 st. C nebo není extrémně

vysoká koncentrace inokula (např. u rostliny S. nigrum rostoucí u

nemocné rostliny bramboru nebo rajčete). Při vadnutí jsou příznaky

stejné jako u rostliny rajčete. Nevadnoucí rostliny S. dulcamara, která

má stonky a kořeny ve vodě, mohou vykazovat vnitřní světle hnědé

zbarvení vodivých pletiv na příčném řezu spodní části stonku nebo částí

stonku pod vodou. Z řezu cévních svazků mohou vytékat bakterie nebo

mohou tvořit vlákna slizu, jestliže je řez stonku ponořen svisle do

vody, a to i při absenci příznaků vadnutí.



2.2. Rychlé screeningové testy



Rychlé screeningové testy mohou napomoci předběžné diagnóze, ale nejsou

dostačující. Použije se jeden nebo více následujících testů:



2.2.1. Test na výtok slizu ze stonku (Viz. 6.1.1.)



2.2.2. Test na přítomnost granulí poly-beta- hydroxybutyrátu (PHB)



Charakteristické granule PHB v buňkách R. solanacearum jsou

zviditelněny obarvením tepelně fixovaných skvrn bakteriálního slizu z

infikovaného pletiva na mikroskopickém sklíčku nilskou modří A nebo

súdánskou černí (viz. oddíl 6.1.2.).



2.2.3. Sérologické aglutinační testy



(Viz. oddíl 6.1.3.)



2.2.4. Jiné testy



Dalšími vhodnými rychlými screeningovými testy jsou test IF (viz.oddíl

6.1.5.), test FISH (viz.oddíl 6.1.7.), testy ELISA (viz.oddíl 6.1.8.) a

testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.).



2.3. Postup při izolaci



a) Odebere se sliz nebo vrstva zbarveného pletiva z cévního prstence

hlízy bramboru nebo z cévních vláken stonku rostliny bramboru, rajčete

nebo jiné vadnoucí hostitelské rostliny. Suspenduje se v malém množství

sterilní destilované vody nebo 50mM fosfátového pufru (dodatek 4) a

nechá se 5-10 minut stát.



b) Připraví se řada desetinásobných ředění suspenze.



c) Přenese se 50-100 ěl suspenze a roztoku na universální živnou půdu

(NA, YPGA neboSPA; viz. dodatek 2) a/nebo Kelmanovo tetrazolové médium

(dodatek 2) a/nebo validované selektivní médium (např. SMSA, viz.

dodatek 2). Rozetře se metodou zřeďovacích roztěrů. Připraví se

případně samostatné misky s rozředěnou buněčnou suspenzí R.

solanacearum biovar 2 k pozitivní kontrole.



d) Inkubuje se 2-6 dní při teplotě 28 st. C.



- Na universální živné půdě vytvářejí virulentní izoláty R.

solanacearum perlově krémově bílé, ploché, nepravidelné a fluidní

kolonie, často s charakteristickými spirálkami ve středu. Aviruletní

formy R. solanacearum tvoří malé kruhové nefluidní máslovité kolonie,

které jsou zcela krémově bílé.



- U Kelmanova tetrazolového média a média SMSA jsou spirálky krvavě

červeně zbarvené. Aviruletní formy R. solanacearum tvoří malé kruhové

nefluidní máslovité kolonie, které jsou zcela temně červené.



2.4 Identifikační testy Ralstonia solanacearum



Testy potvrzující výskyt R. solanacearum v podezřelých izolátech jsou

popsány v bodu 6.2.



3. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vzorcích hlíz

bramboru



3.1. Podrobné metody pro detekci a identifikaci Ralstonia solanacearum

ve vzorcích bezpříznakových hlíz bramboru



3.1.1. Příprava vzorků



Poznámka:



- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na jeden test. Intenzivnější

vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší

množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu

výsledků. Postup lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami,

pokud je k dipozici menší množství hlíz.



- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na

testování vzorků o velikosti 200 hlíz.



- Extrakt bramboru popsaný níže může být rovněž použit pro zjištění

původce bakteriální kroužkovitosti bramboru. Clavibacter michiganensis

subsp. sepedonicus.



Nepovinné ošetření před přípravou vzorku



a) Inkubace vzorků při teplotě 2-30 st. C po dobu až 2 týdnů před

testováním na podporu množení všech populací R. solanacearum.



b) Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné desinfekční prostředky (s obsahem

chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění patogenní

DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout

na vzduchu. Tento postup mytí je vhodný zvláště v případě, když je ve

vzorcích příliš zeminy nebo jestliže má být proveden test PCR nebo

přímá izolace.



3.1.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nože na

zeleninu se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy, tak aby bylo

viditelné vodivé pletivo. Opatrně se vyříznou malé výkrojky vodivých

pletiv na pupkovém konci. Množství pletiva nezahrnující cévní svazky se

omezí na minimum.



Poznámka:



Všechny (hnijící) hlízy s podezřelými příznaky hnědé hniloby se dají

stranou a testují se odděleně.



Pokud jsou při vyříznutí výkrojku zjištěny příznaky podezření na hnědou

hnilobu, provede se vizuální vyšetření takové hlízy na řezu hlízy na

pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se

uchovávají po dobu nejméně 2 dnů při pokojové teplotě, aby mohlo dojít

ke zkorkovatění (suberizaci) a potom se uchovávají v chladu (4-10 st.

C) za řádných karanténních podmínek. Všechny hlízy včetně hlíz s

podezřelými příznaky by měly být uchovány podle přílohy III.



3.1.1.2. Výkrojky z pupkové části se uloží do nepoužitých nádob na

jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě,

že nádoby jsou znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a

dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat

výkrojky z pupkového konce okamžitě. Není-li to možné, uchovávají se v

nádobě bez přidání pufru; v chladu nejdéle 72 hodin nebo při pokojové

teplotě (18 - 25 st. C) nejdéle 24 hodin.



Výkrojky z pupkových konců se zpracují jedním z následujících postupů:



a) Zalijí se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního pufru

(dodatek 4) a třepou se v rotační třepačce (50-100 ot./min) 4 hodiny

při teplotě nižší než 24 st. C nebo 16-24 hodin chlazené, nebo



b) homogenizují se dostatečným množství (přibližně 40 ml) extrakčního

pufru (dodatek 4) buď v mixéru (např. Waring nebo Ultra Thurax) nebo

drcením v utěsněném maceračním sáčku na jedno použití (např. silný

polyethylenový sáček Stomacher nebo Bioreba, 150mm x 250mm, sterilovaný

zářením) pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např.

Homex).



Poznámka:



Při homogenizaci vzorků pomocí mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové

kontaminace vzorků. Je nutné zamezit vzniku aerosolu nebo rozlití během

extrakčního procesu. Pro každý vzorek se použijí čerstvě sterilované

nože (ostří) a nádoby. Při testu PCR je nutno zabránit přenosu DNA na

nádobách nebo v mlecím přístroji. U testu PCR se doporučuje použít

drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavek na jedno použití.



3.1.1.3. Supernatant se dekantuje. Je-li příliš zakalený, pročistí se

buď pomalým odstřeďováním (nejvýš 180 g po dobu 10 minut při teplotě

4-10 st. C) nebo vakuovou filtrací (40-100µm), filtr se omyje přídavkem

(10ml) extrakčního pufru.



3.1.1.4. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním, 7 000g po dobu 15

minut (nebo 10 000 g po dobu 10 minut) při teplotě 4-10 st. C a

odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.



3.1.1.5. Peleta se resuspenduje v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 4).

Použije se 500 µl pro R. solanacearum, 500 µl pro Clavibacter

michiganensis subsp. sepedonicus a 500 µl pro referenční účely. Přidá

se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10 - 25% (v/v) k 500 µl

referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se

vířením a uloží se při teplotě -16 až -24 st. C (týdny) nebo - 68 až

-86 st. C (měsíce). Extrakty se uchovávají během testování při teplotě

4-10 st. C.



Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.



Je-li nutná přeprava extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu s

doručením do 24 až 48 hodin.



3.1.1.6. Je nezbytně nutné, aby všechny pozitivní kontroly a vzorky R.

solanacearum byly uchovány a zpracovány odděleně, aby se zabránilo

vzájemné kontaminaci. To platí pro sklíčka IF a všechny testy.



3.1.2. Testování



Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v

příslušných dodatcích:



Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)



IF test (viz.oddíl 6.1.5.)



Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)



Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)



Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)



Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)



3.2. Podrobné metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve

vzorcích bezpříznakových rostlin bramboru, rajčete nebo jiných

hostitelských rostlin



3.2.1. Příprava vzorků



Poznámka:



Pro účely detekce latentních populací R. solanacearum se doporučuje

testovat smíšené vzorky. Postup lze vhodně použít na smíšené vzorky o

počtu až 200 stonkových částí. Provádí-li se průzkum, měl by být

založen na statisticky reprezentativním vzorku zkoumané rostlinné

populace.



3.2.1.1. Do uzavřené sterilní nádoby se uloží 1- 2 cm dlouhé kousky

stonků podle následujícího postupu vzorkování:



Rajčatové sazenice z předpěstírny: Čistým dezinfikovaným nožem se

odebere kousek dlouhý 1 cm z paty každého stonku hned nad úrovní země.



Rostliny z pole nebo skleníku: Čistým dezinfikovaným nožem se odebere

nejspodnější postranní výhonek z každé rostliny uříznutý hned nad

spojením s hlavním stonkem. Odebere se nejspodnější, 1 cm dlouhý díl z

každého výhonku. Jiné hostitelské rostliny: Čistým dezinfikovaným nožem

nebo zahradnickými nůžkami se odebere 1 cm dlouhý díl z paty každého

stonku hned nad úrovní země. U lilku potměchuti (S. dulcamara) nebo

jiných hostitelských rostlin rostoucích ve vodě se odeberou 1-2 cm díly

ze stonku pod vodou nebo oddenků s vodními kořeny.



Při vzorkování určité oblasti se doporučuje testovat statisticky

representativní vzorek o počtu nejméně 10 rostlin na 1 vzorkovací místo

pro každou potenciální plevelnou hostitelskou rostlinu. Detekce

patogenu bude nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu,

ačkoli přirozenou infekci je možné zjistit po celý rok u víceleté

Solanum dulcamara rostoucí ve vodních tocích. Mezi známé hostitelské

rostliny patří plevelné rostliny bramboru, Solanum dulcamara, S.

nigrum, Datura stramonium a další zástupci čeledi Solanaceae. Dalšími

hostitelskými rostlinami jsou rostliny rodu Pelargonium spp. a

Portulaca oleracea. Některé evropské plevelné druhy, které mohou hostit

populace R. solanacearum biovar 2/Race 3 v kořenech a/nebo oddencích za

specifických podmínek, zahrnují Atriplex hastata, Bidens pilosa,

Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum,

Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp.,

Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra a Urtica dioica.



Poznámka:



V této fázi je možné provést vizuální šetření vnitřních příznaků

(zbarvení cév nebo bakteriální sliz). Jakýkoli díl stonku s příznaky se

dá stranou a testuje se odděleně (viz. oddíl 2.).



3.2.1.2. Části stonku se krátce dezinfikují 70% etanolem a ihned vysuší

savým papírem. Potom se zpracují části stonku jedním z následujících

postupů:



a) zalijí se části dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního

pufru (dodatek 4) a třepou na rotační třepačce (50-100 ot./min) 4

hodiny při teplotě do 24oC nebo 16-24 hodin chlazené,



nebo



b) se ihned zpracují drcením v pevném maceračním sáčku (např. Stomacher

nebo Bioreba) s přiměřeným množstvím extrakčního pufru (dodatek 4)

pomocí gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení (např. Homex).

Není-li to možné, uloží se části stonků v chladu nejdéle na 72 hodin

nebo při pokojové teplotě (18 - 25oC) na 24 hodin.



3.2.1.3. Po usazení, které má trvat 15 minut, se dekantuje supernatant.



3.2.1.4. Další pročišťování extraktu nebo zahušťování bakteriální

frakce obvykle není třeba, ale lze je provést filtrací a/nebo

odstřeďováním popsaným v oddíle 3.1.1.3. až 3.1.1.5.



3.2.1.5. Čistý nebo koncentrovaný vzorkový extrakt se rozdělí na dva

stejné díly. Jeden díl se testuje při teplotě 4-10 st. C a druhý díl se

skladuje v 10-25% (v/v) sterilním glycerolu při teplotě -16 až -24 st.

C (týdny) nebo -68 až -86oC (měsíce) pro případné další testování.



3.2.2. Testování



Postupové diagramy a popisy testů a optimalizovaných protokolů jsou v

příslušných dodatcích:



Selektivní izolace (viz. oddíl 6.1.4.)



Test IF (viz. oddíl 6.1.5.)



Testy PCR (viz. oddíl 6.1.6.)



Test FISH (viz. oddíl 6.1.7.)



Testy ELISA (viz. oddíl 6.1.8.)



Biotest (viz. oddíl 6.1.9.)



4. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby ve vodě



4.1 Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum ve

vodě



-----



(1) Viz. oddíl 4.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování.



(2) Metody koncentrace patogenu jsou popsány v oddíle 4.2.1.

Koncentrace zvětšuje populaci jak patogenu, tak konkurenčních

saprofytických bakterií a doporučuje se jen tehdy, jestliže nebrání

izolačnímu testu.



(3) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.



(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.



(5) Metody obohacovacího testu PCR jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a

6.1.6.



(6) Metody obohacovacího testu ELISA jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a

6.1.8.



(7) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.



(8) Kultivace může selhat z důvodu konkurence nebo inhibice

saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření, že velká saprofytická

populace ovlivní spolehlivost izolace, opakují se izolační testy po

zředění vzorku sterilní vodou.



(9) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum

se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.



(10) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.



4.2. Metody detekce a identifikace R. solanacearum ve vodě



Princip



Validované schéma detekce popsané v tomto oddíle je použitelné k

detekci patogenu ve vzorcích povrchové vody a rovněž může být použito k

testování vzorků odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody.

Očekávaná citlivost detekce se však liší v závislosti na substrátu.

Citlivost testu selektivní izolace je ovlivňována populacemi

konkurenčních saprofytických bakterií, kterých je obecně mnohem více v

odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě než v povrchové vodě.

Zatímco níže uvedené schéma předpokládá detekci asi 103 buněk/litr

povrchové vody, citlivost detekce v odpadní vodě ze zpracování brambor

a odpadní vodě bude pravděpodobně podstatně nižší. Z tohoto důvodu se

doporučuje testovat odpadní vodu po provedení nějakého čistícího

postupu (např. sedimentace nebo filtrace), při nichž dojde ke snížení

saprofytických bakteriálních populací. Omezení citlivosti testovacího

schématu by mělo být bráno v úvahu při hodnocení spolehlivosti v

případě získání negativních výsledků.Vzhledem k tomu, že se toto schéma

používá úspěšně k mapování výskytu nebo nepřítomnosti patogenu v

povrchové vodě, je třeba si uvědomit jeho omezení při použití k

podobnému mapování v odpadní vodě ze zpracování brambor a v odpadní

vodě.



4.2.1. Příprava vzorků



Poznámka:



- Zjištění R. solanacearum v povrchové vodě je nejspolehlivější v

období pozdního jara, léta a podzimu, kdy teplota vody překračuje 15

st. C.



- Opakované vzorkování v různé době během výše uvedených období na

určených vzorkovacích místech zvýší spolehlivost zjištění snížením

vlivů výkyvů povětrnostních podmínek.



- Vlivem silných dešťů a geografie vodního toku může dojít ke značnému

zředění a tím i zastření výskytu patogenu.



- Vzorky vody se odebírají v blízkosti hostitelských rostlin, pokud

jsou přítomny.



4.2.1.1. Na vybraných vzorkovacích místech se odeberou vzorky vody do

sterilních zkumavek nebo lahviček na jedno použití, pokud možno 30 cm

pod hladinou a 2 m od břehu. Při vzorkování odpadní vody ze zpracování

brambor a odpadní vody se odeberou vzorky z místa výtoku odpadní vody.

Doporučená velikost vzorku je 500 ml. Je-li upřednostňována menší

velikost, doporučuje se odebrat vzorky nejméně 3krát pro každé

vzorkovací místo, z nichž každý bude obsahovat 2 opakované dílčí vzorky

o velikosti nejméně 30 ml. Při intenzivním mapování se vyberou nejméně

3 vzorkovací místa na každé 3 km vodního toku a vzorkují se rovněž

přítoky.



4.2.1.2. Vzorky se přepravují v chladu a temnu (4-10 st. C) a testují

do 24 hodin.



4.2.1.3. Je-li potřeba, může být provedena koncentrace bakteriální

frakce pomocí následujících metod:



a) Odstřeďují se 30-50 ml dílčí vzorky při 10 000 g po dobu 10 minut

(nebo 7000 g po dobu 15 minut), pokud možno při teplotě 4-10 st. C,

slije se kapalina nad usazeninou a resuspenduje se peleta v 1 ml pufru

(dodatek 4).



b) Provede se filtrace přes membránu (minimální velikost pórů 0,45 µm)

s následným promytím filtru v 5-10 ml peletového pufru a zachycením

filtrátu. Tato metoda je vhodná pro velké objemy vody, které obsahují

malý počet saprofytů.



Koncentrace se obvykle nedoporučuje u vzorků vody ze zpracování brambor

nebo u vzorků odpadní vody, protože zvýšená populace konkurenčních

saprofytických bakterií inhibuje detekci Ralstonia solanacearum.



4.2.2. Testování



Viz. postupový diagram a popis testů v příslušných dodatcích.



5. Detekce a identifikace původce hnědé hniloby v půdě



5.1. Postupový diagram pro detekci a identifikaci R. solanacearum v

půdě



-----



(1) Viz. oddíl 5.2.1., kde jsou uvedeny doporučené postupy vzorkování



(2) Selektivní izolační test je popsán v oddíle 6.1.4.



(3) Obohacovací PCR testy jsou popsány v oddíle 6.1.4.2. a 6.1.6.



(4) Biotest je popsán v oddíle 6.1.9.



(5) Typická morfologie kolonie je popsána v oddíle 2.3.d.



(6) Kultivace může selhat z důvodů konkurence nebo inhibice

saprofytickými bakteriemi. Je-li podezření na vliv saprofytické

populace na spolehlivost izolace, opakují se testy selektivní izolace

po dalším zředění vzorku.



(7) Spolehlivá identifikace podezřelých čistých kultur R. solanacearum

se dosáhne pomocí testů popsaných v oddíle 6.2.



(8) Test patogenity je popsán v oddíle 6.3.



5.2. Metody pro detekci a identifikaci R. solanacearum v půdě



Principy



Platné detekční schéma popsané v tomto oddíle je použitelné pro detekci

patogenu ve vzorcích půdy, ale může být rovněž použito k testování

vzorků pevného odpadu při zpracování brambor nebo kalu z odpadní vody.

Je však nutné poznamenat, že tyto metody nejsou dostatečně citlivé, aby

zaručovaly detekci nízkých nebo nepravidelně rozptýlených populací

Ralstonia solanacearum, které se mohou vyskytovat v přirozeně

infikovaných vzorcích těchto substrátů.



Při hodnocení spolehlivosti všech získaných negativních výsledků a také

při sestavování přehledů určujících přítomnost patogenu v půdě nebo

kalu je třeba vzít v úvahu omezenou citlivost tohoto testovacího

schématu. Nejspolehlivějším testem přítomnosti patogenu v polní půdě je

vypěstování náchylné hostitelské rostliny a její sledování, zda není

infikována, ale i při použití této metody unikne nízký stupeň zamoření

pozornosti.



5.2.1. Příprava vzorků



5.2.1.1. Vzorkování polní půdy by se mělo řídit standardními principy

používanými pro vzorkování hlístů. Na jeden vzorek se shromáždí 0,5 až

1 kg půdy ze 60 míst na ploše 0,3 ha z hloubky 10-20 cm. Je-li

podezření na výskyt patogenu, zvyší se počet sběrných míst na 120 z

plochy 0,3 ha. Před testováním se uchovávají vzorky při teplotě 12-15

st. C. Kal ze zpracování brambor a kanalizace se navzorkuje

shromážděním celkem 1 kg z míst reprezentujících celkový objem

testovaného kalu. Před testováním se každý vzorek dobře promíchá.



5.2.1.2. Dílčí vzorky 10-25 g půdy nebo kalu se rozptýlí rotační

třepačkou (250 ot./min) v 60-150 ml extrakčního pufru (dodatek 4) po

dobu 2 hodin. Je-li třeba, přidání 0,02% sterilního Tween-20 a 10-20 g

sterilních kamínků může napomoci disperzi.



5.2.1.3. Během testování se udržuje suspenze v teplotě 4 st. C.



5.2.2. Testování



Postupový diagram a popis testů jsou v příslušném dodatku.



6. Optimalizované protokoly pro detekci a identifikaci R. solanacearum



6.1. Diagnostické a detekční testy



6.1.1. Test na výtok slizu ze stonku



Přítomnost R. solanacearum ve stoncích vadnoucích rostlin bramboru,

rajčete nebo jiných hostitelských rostlin může ukázat následující

jednoduchý test pravděpodobného výskytu: uřízne se stonek právě nad

úrovní země. Řez stonku se ponoří do zkumavky s čistou vodou.

Sleduje,se, zda se po několika minutách objeví charakteristická

samovolně proudící vlákna bakteriálního slizu z přeříznutých cévních

svazků.



6.1.2. Test na přítomnost granulí poly-beta- hydroxybutyrátu



1. Připraví se roztěr bakteriálního slizu z infikovaného pletiva nebo

ze 48 hodinové kultury na živné půdě YPGA nebo SPA (dodatek 2) na

mikroskopické sklíčko.



2. Připraví se pozitivní kontrolní roztěr kmenu biovaru 2 R.

solanacearum a případně negativní kontrolní roztěr o známém PHB

negativním sp.



3. Roztěry se nechají uschnout a spodní povrch každého sklíčka se

rychle protáhne nad plamenem, aby se roztěry fixovaly.



4. Preparáty se obarví buď nilskou modří nebo súdánskou černí a provede

se mikroskopické pozorování podle níže uvedeného popisu:



Test nilskou modří:



a) Obě sklíčka se zakápnou 1% vodným roztokem nilské modři a nechají se

inkubovat 10 minut při teplotě 55 st. C.



b) Odstraní se barvící roztok. Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z

kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.



c) Roztěr se zakápne 8% vodním roztokem kyseliny octové a nechá se

inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě.



d) Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku.



Přebytečná voda se odsaje savým papírem.



e) Znovu se navlhčí kapkou vody a přiloží se krycí sklíčko.



f) Zkoumá se obarvený roztěr epifluorescenčním mikroskopem při 450 nm

pod olejovou nebo vodní imersí se zvětšením 600x až 1000x s použitím

objektivu pro olejovou nebo vodní imersi.



g) Pozoruje se, zda se objeví na PHB granulích jasně oranžová

fluorescence. Také se pozoruje v procházejícím normálním světle, zda

jsou granule intracelulární a zda je morfologie buněk typická pro R.

solanacearum.



Test súdánskou černí:



a) Zakápnou se všechna sklíčka 0,3% roztokem súdánské černi B v 70%

etanolu a inkubují se 10 minut při pokojové teplotě.



b) Odstraní se barvící roztok a krátce se opláchne jemně tekoucí vodou

z kohoutku a odsaje se přebytečná voda savým papírem.



c) Sklíčka se ponoří krátce do xylolu a vysají se savým papírem.

Upozornění : Xylol je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná

bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.



d) Sklíčka se zakápnou 0,5% (w/v) vodným roztokem safraninu a nechají

10 vteřin inkubovat při pokojové teplotě.



Upozornění: safranin je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná

bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.



e) Sklíčka se opláchnou jemně tekoucí vodou z kohoutku, odsaje se

přebytečná voda savým papírem a přiloží se krycí sklíčko.



f) Zkoumá se obarvený roztěr mikroskopem s procházejícím světlem pod

olejovou imersí a při zvětšení 1 000x.



g) Hledá se modročerné zbarvení PHB granulí v buňkách R. solanacearum s

růžově zbarvenými stěnami buněk.



6.1.3. Sérologické aglutinační testy



Aglutinace buněk R. solanacearum v bakteriálním slizu nebo v extraktech

z pletiv s příznaky je nejlépe pozorovatelná pomocí validovaných

protilátek (viz. dodatek 3) označených příslušnými obarvenými

značkovači, např. červenými buňkami Staphylococcus aureus nebo

obarvenými latexovými částicemi. Při použití komerčně dostupného

vybavení (viz. dodatek 3) se postupuje podle instrukcí výrobce. Jinak

je postup následující:



a) Smíchají se kapky suspenze označené protilátky a bakteriálního slizu

(přibližně 5 µl každé látky) na okénku testovacího víceokénkového

sklíčka.



b) Připraví se pozitivní a negativní kontrolní vzorky použitím suspenzí

biovaru 2 R. solanacearum a heterologního kmenu.



c) Pozoruje se, zda se v pozitivních vzorcích po jemném míchání po dobu

15 sekund objeví aglutinace.



6.1.4. Selektivní izolace



6.1.4.1. Očkování na živnou půdu



Poznámka:



Než se použije tato metoda poprvé, provede se předběžný test k

zajištění reprodukovatelné detekce 103 až 104 jednotek tvořících

kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaných do extraktů ze vzorků, které

byly předtím testovány s negativním výsledkem.



Použije se řádně validovaná selektivní živná půda, např. SMSA (ve znění

Elphinstone et al., 1996; viz. dodatek 2).



Rozlišení R. solanacearum od jiných bakterií schopných na živné půdě

růst vyžaduje velkou pozornost. Dále, kolonie R. solanacearum mohou mít

atypickou morfologii, jestliže Petriho misky jsou přeplněny nebo jsou

rovněž přítomny antagonistické bakterie. Je-li podezření na konkurenci

nebo inhibici, měl by být vzorek otestován znovu pomocí jiného testu.



Při použití čerstvě připravených extraktů ze vzorků lez očekávat, že

citlivost detekce touto metodou bude velmi vysoká. Metoda je však

použitelná i pro extrakty, které byly uchovány v glycerolu při teplotě

od -68 do -86 st. C.



Pozitivní kontroly se připraví jako desetinné ředění ze suspenze 106

cfu/ml virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum (např. NCPPB 4156 =

PD 2762= CFBP 3857). K vyloučení možné kontaminace se připraví

pozitivní kontrolní vzorky zcela odděleně od vzorků k testování. U

každé nově připravené šarže selektivní živné půdy by měla být před

jejím použitím k rutinnímu testování vzorků nejdříve otestována její

vhodnost pro kultivaci patogenu. Kontrolní materiál se testuje týmž

způsobem jako vzorek (vzorky).



1. Provede se ředění s cílem zajistit, aby všechny populace

saprofytických bakterií byly vyloučeny. Nanese se 50- 100 µl extraktu

vzorku na 1 misku pro každé ředění.



2. Misky se nechají inkubovat při teplotě 28 st. C. Po 48 hodinách se

zkontroluje jejich stav a pak se provádí kontrola denně po 6 dní.

Typické kolonie R. solanacearum na živné půdě SMSA jsou mléčně bílé,

ploché, nepravidelné a fluidní a po 3 dnech inkubace se rozvine růžově

až krvavě červené zbarvení ve středu s vnitřními pruhy nebo spirálami.



Poznámka:



Někdy se na tomto médiu tvoří atypické kolonie R. solanacearum. Mohou

být malé, kruhové, zcela červené a nefluidní nebo jen částečně fluidní,

a proto obtížně rozeznatelné od saprofytických bakterií tvořících

kolonie.



3. Předpokládané kolonie R. solanacearum se rozetřou nebo očkují

metodou zřeďování na universální živnou půdu, aby se získaly izolované

kolonie (viz. dodatek 2).



4. Kultury se uchovávají krátkodobě ve sterilní vodě (pH 6-8, bez

chlóru) při pokojové teplotě v temnu nebo dlouhodobě ve vhodném

ochranném médiu při teplotě -68 až -86oC nebo lyofilizované.



5. Provede se identifikace podezřelých kultur (viz. oddíl 6.2.) a test

patogenity (viz oddíl 6.3).



Interpretace výsledků testu očkováním na selektivní média. Test

očkování na selektivní média je negativní, jestliže po 6 dnech nejsou

zpozorovány žádné bakterie nebo nejsou nalezeny žádné podezřelé kolonie

typické pro R. solanacearum , za předpokladu, že nedošlo k inhibici

jinými bakteriemi a v kontrolních vzorcích jsou nalezeny typické

kolonie R. solanacearum.



Test očkování na selektivní média je pozitivní, jestliže jsou izolovány

podezřelé kolonie R. solanacearum.



6.1.4.2. Obohacovací testy



Použije se validované médium pro obohacení, např. modifikovaný bujón

Wilbrink (viz dodatek 2).



Tento postup lze použít pro selektivní zvětšení populací R.

solanacearum v extraktech ze vzorků a zvýšení citlivosti detekce. Tímto

způsobem dojde i ke zředění potenciálních inhibitorů PCR testu (1:100).

Obohacení R. solanacearum však může být neúspěšné z důvodů konkurence

nebo antagonismu saprofytických organismů, které bývají často současně

také obohaceny. Z tohoto důvodu může být izolace R. solanacearum z

obohacené kultury obtížná. Kromě toho, protože může dojít k rozvoji

populací sérologicky příbuzných saprofytů, se pro test ELISA doporučuje

použít místo polyklonálních protilátek specifické monoklonální

protilátky.



1. U obohacovacího testu PCR se přenese 100 ul extraktu ze vzorku do 10

ml obohaceného bujónu (dodatek 2), který se předem připraví do

sterilních zkumavek nebo baněk. U obohacovacího testu ELISA může být

použit větší podíl extraktu ze vzorku do bujónu (např. 100 ul v 1,0 ml

obohacené živné půdy).



2. Inkubuje se 72 hodin při teplotě 27 až 30 °C v třepané nebo statické

kultuře s uvolněnými uzávěry, které umožní provzdušňování.



3. Před zahájením testů ELISA nebo PCR se obsah dobře promíchá.



4. S obohaceným bujónem se zachází týmž způsobem jako se vzorky ve výše

uvedených testech.



Poznámka:



Očekává-li se inhibice obohacení R. solanacearum z důvodu vysoké

koncentrace konkurenčních saprofytických bakterií, lze docílit lepších

výsledků obohacením extraktů ze vzorků před jakýmkoli odstřeďováním

nebo jinými postupy zvyšování koncentrace.



6.1.5. Test IF



Postup



Použití testu IF jako hlavního screeningového testu se doporučuje kvůli

dokázané spolehlivosti v dosažení požadovaných prahů.



Použije-li se test IF jako hlavní a výsledek IF testu je pozitivní,

musí být jako druhý screeningový test použit test izolace, PCR nebo

FISH. Jestliže je test IF použit jako druhý screeningový test a je

pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu,

aby byla analýza úplná.



Poznámka:



Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se

určit titr pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako

nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování

suspenze obsahující 105 až 106 buněk/ml homologického kmene R.

solanacearum a použitím vhodného konjugátu fluorescenčního

isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Validovaná

polyklonální antiséra mají všechna titr IF nejméně 1:2 000. Během

testování by měly být použity protilátky v pracovních ředěních blízkých

nebo stejných jako titr.



Test by měl být proveden na čerstvě připravených extraktech ze vzorků.

Jestliže je to nutné, může být úspěšně proveden na vzorcích uchovaných

při teplotě - 68 až - 86 °C v glycerolu. Glycerol může být ze vzorku

odstraněn přidáním 1 ml pufru (dodatek 4), 15minutovým odstřeďováním

při 7000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. Často to

není potřeba, zvláště pokud jsou vzorky fixovány na sklíčka plamenem.

Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem

nebo jiným referenčním kmenem R. solanacearum suspendovaným v

bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B, a nepovinně v

pufru.



Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo

zmrazením při teplotě - 16 až 24 °C) by se mělo podle možností použít

jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.



Jako negativní kontroly se použijí alikvotní díly extraktů ze vzorků,

které byly předtím testovány s negativním výsledkem.



Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze

použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3. Použijí se

mikroskopická sklíčka s více okénky, pokud možno s 10 okénky s průměrem

nejméně 6 mm.



Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.



6.1.5.1. Připraví se sklíčka k testování jedním z následujících

postupů:



i) Pro pelety s relativně nízkým množstvím sedimentu škrobu:



Napipetuje se odměřené standardní množství (15 µl je vhodné pro průměr

okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru)

resuspendované bramborové pelety v ředění 1/100 do prvního okénka.

Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do

zbývajících okének v řadě. Druhá řada může být použita jako duplikát

nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr. 1.



ii) Pro jiné pelety:



Připraví se desetinná ředění (1/10, 1/100) resuspendované pelety v

peletovém pufru. Napipetuje se odměřené standardní množství (15 µl je

vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v

příslušném poměru) resuspendované pelety pro každé ředění do řady

okének. Druhá řada může být použita jako rezervní nebo pro druhý

vzorek, jak ukazuje obr.2.



6.1.5.2. Vysuší se kapičky při okolní teplotě nebo zahřátím na teplotu

40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15

minut při teplotě 60 °C), plamenem, 95 % etanolem nebo podle

konkrétních instrukcí od dodavatele protilátek.



Pokud je potřeba, fixovaná sklíčka je možné skladovat ve zmrazeném

stavu v suchém boxu po nezbytně krátkou dobu (maximálně 3 měsíce) před

dalším testováním.



6.1.5.3. Postup IF



i) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.i): Připraví se sada

dvojnásobných zředění. První jamka by měla mít 1/2 titru (T/2), ostatní

1/4 titru (T/4), 1/2 titru (T/2), titr (T) a dvojnásobek titru (2T).



ii) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.ii): Připraví se

pracovní ředění (PŘ) protilátek v pufru IF. Pracovní ředění ovlivňuje

přesnost.



Obrázek 1. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.i) a 6.1.5.3.i)



Obrázek 2. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.ii) a

6.1.5.3.ii)



1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený savý papír. Každé

testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství

protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství

použitého extraktu.



Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek,

postupuje se následovně:



2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30

minut při pokojové teplotě (18-25 st. C).



3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě

opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF

Tween (dodatek 4) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku

aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou

kontaminaci. Pečlivě se odstraní přebytečná vlhkost jemným osušením.



4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí

ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu

naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.



5. Sklíčka se inkubují zakrytá na vlhkém papíru po dobu 30 minut při

pokojové teplotě (18-25 st. C).



6. Setřesou se kapky konjugátu ze sklíčka. Sklíčko se opláchne a umyje

jako předtím (3.). Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.



7. Napipetuje se 5-10 ul 0,1M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek

4) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží se krycí

sklíčko.



6.1.5.4. Vyhodnocení IF testu



1. Prohlížejí se testovací sklíčka epifluorescenčním mikroskopem s

filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při

zvětšení 500x až 1 000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých

průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se

zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.



Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně

fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo

pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF

opakován (odst. 6.1.5).



2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií

R. solanacearum v testovacích okéncích sklíčka. Intenzita fluorescence

musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění

protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou

fluorescencí nelze brát v úvahu.



Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se

může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky

díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka

sklíček) na povrchu sklíček.



3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost

imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí

stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s

atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s

velikostí a morfologií podobnou R. solanacearum.



4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a

morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu

6.1.5.3.



5. Interpretace výsledků testu IF:



i) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se

odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a

vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek

5).



Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml

resuspendované pelety nejméně 5 x 103. Vzorek je považován za

potenciálně infikovaný a je povinné další testování.



ii) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než

5 x 103 buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za

negativní. Další testování není nutné.



6.1.6. Testy PCR



Principy



Použije-li se test PCR jako hlavní screeningový test a výsledek je

pozitivní, musí být povinně proveden druhý screeningový test, a sice

izolace nebo IF. Jestliže je PCR použita jako druhý screeningový test a

je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového

diagramu, aby byla analýza úplná.



Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu

se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.



Poznámka:



Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné

zjištění 103 až 104 buněk R. solanacearum na 1 ml přidaný do vzorků

extraktů, které byly předtím testovány jako negativní. Dosažení

maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích může vyžadovat

optimalizační pokusy. Použijí se schválená činidla a protokoly PCR (viz

dodatek 6). Pokud možno, zvolí se metoda s interní kontrolou.



Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření k zabránění kontaminace

vzorku cílovou DNA. Test PCR by měl být prováděn zkušenými laboranty v

laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se

minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.



S negativními kontrolami (v průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy

zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k

přenosu DNA.



PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:



- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s

negativním výsledkem,



- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterií a DNA ze vzorku,



- reakční směs PCR.



Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:



- alikvotní části resuspendovaných pelet, do kterých byla přidána R.

solanacearum (přípravu viz dodatek 3 B);



- suspenze 106 buněk na 1 ml R. solanacearum ve vodě z virulentního

izolátu (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3 B);



- pokud možno, při PCR použít také DNA extrahovanou z pozitivních

kontrolních vzorků.



Aby se zabránilo případné kontaminaci, připravují se pozitivní kontroly

v prostředí odděleném od vzorků, které budou testovány.



Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě

použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.



Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze

použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.



6.1.6.1. Metody purifikace DNA



Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz.

dodatek 3).



Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.



K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici

různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a

koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla

optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v

dodatku 6.



a) Metoda podle Patrika (2000)



1. Napipetuje se 220 µl lyzátového pufru (100mM NaCl, 10 mM Tris-HCl

(pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky.



2. Přidá se 100 µl extraktu ze vzorku a mikrozkumavka se umístí do

termobloku nebo vodní lázně s teplotou 95 °C na 10 min.



3. Mikrozkumavka se vloží na 5 min. do ledu.



4. Přidá se 80 µl zásobního roztoku lysozymu (50 mg lysozymu/na 1 ml 10

mM TrisHCl, pH 8,0) a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.



5. Přidá se 220 µl roztoku Easy DNA(R) A (Invitrogen), dobře promíchá

třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.



6. Přidá se 100 µl roztoku Easy DNA(R) B (Invitrogen), důkladně

promíchá třepáním, pokud vzorek nezačne být stejnoměrně viskózní.



7. Přidá se 500 µl chloroformu a promíchá, až se viskozita sníží a směs

se stane homogenní.



8. Pro oddělení fází a vytvoření mezifáze se směs odstřeďuje při 15 000

g po dobu 20 min. při teplotě 4 °C.



9. Horní fáze se převede do nové Eppendorfovy mikrozkumavky.



10. Přidá se 1 ml 100 % etanolu (- 20 °C), krátce promíchá třepáním a

inkubuje se na ledu po dobu 10 min.



11. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C a

odstraní se etanol z pelety.



12. Přidá se 500 µl 80 % etanolu (- 20 °C) a promíchá se překlápěním

mikrozkumavky.



13. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C,

zachová se peleta a odstraní etanol.



14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA odparce.



15. Peleta se resuspenduje v 100 µl sterilní UPW a nechá se stát při

pokojové teplotě nejméně 20 minut.



16. Skladuje se při teplotě - 20 °C až do použití při PCR.



17. Jakákoliv bílá sraženina se odstraní odstředěním. 5 µl supernatantu

obsahujícího DNA se použije pro test PCR.



b) Jiné metody



Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly

použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních

vzorků obsahujících 103 až 104 patogenních buněk na 1 ml stejně

efektivní.



6.1.6.2. PCR



1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle schválených

protokolů (6.1.6). Připraví se desetinásobné ředění vzorku extraktu DNA

(1:10 ve sterilní vodě).



2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, ve kterém

nehrozí kontaminace podle zveřejněných protokolů (dodatek 6). Pokud

možno, doporučuje se použít multiplexní protokol PCR, který rovněž

zahrnuje interní protokol PCR.



3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 µl extraktu DNA na 25 µl

PCR reakce podle protokolů PCR (viz dodatek 6).



4. Přidají se negativní kontrolní vzorky obsahující pouze reakční směs

PCR a přidá se týž zdroj UPW jako byl ten, který byl použit ve směsi

PCR místo vzorku.



5. PCR mikrozkumavky se umístí do téhož termocykleru, který byl použit

při počátečním testování, a spustí se vhodně optimalizovaný program PCR

(dodatek 6).



6.1.6.3. Analýza produktu PCR



1. Amplikony se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se

nejméně 12 µl směsi amplifikované DNA z každého vzorku s 3 µl

nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v

Tris-acetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5-8 V/cm. Použije se

vhodný DNA marker, např. (ladder) 100 bp.



2. Detekují se proužky DNA obarvením v ethidiumbromidu (0,5 mg/l) po

dobu 30-60 minut za použití vhodných bezpečnostních opatření pro

zacházení s tímto mutagenem.



3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky např. 302 nm) prosvíceném gelu

se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek

se zdokumentuje.



4. U všech nových nálezů/případů se zkontroluje pravost amplikonu PCR

provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku

amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a čase shodným

restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Naštěpené fragmenty se

rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický

vzor restrikčních fragmentů pod UV světlem po obarvení ethidiumbromidem

a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.



Interpretace výsledků testu PCR



Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R.

solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale

je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě

vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro

rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován

se zkoumaným vzorkem). Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn

amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a

(případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku

negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také

získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).



Poznámka:



Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný

amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve

vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v

bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních

protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce,

jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.



V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků

negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.



6.1.7. Test FISH



Princip



Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní,

musí být jako druhý povinný screeningový test provedena izolace nebo IF

test. Když se FISH test provede jako druhý vyšetřovací test a je

pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle

postupového diagramu.



Poznámka:



Používají se schválené oligosondy specifické pro R. solanacearum

(dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit

reprodukovatelné zjištění alespoň 103-104 buněk R. solanacearum na ml

přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s

negativním výsledkem. Následující postup by měl být pokud možno

proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně

provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě - 16 až

- 24 °C nebo - 68 až - 86 °C.



Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku,

který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem.



Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující 105 až 106

buněk na 1 ml R. solanacearum biovar 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762

= CFBP 3857, viz dodatek 3) v 0,01M fosfátovém pufru (PB) ze 3-5 denní

kultury. Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními

vzorky homologického kmenu nebo jiného referenčního kmene R.

solanacearum, suspendovaného v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v

dodatku 3 B. Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje

kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie

přítomné ve vzorku.



Standardizovaný pozitivní a negativní kontrolní materiál, který se

používá v tomto testu, je uveden v dodatku 3 bodu A. Test kontrolního

materiálu se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů).



6.1.7.1. Fixace bramborového extraktu



Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).



1 Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7).



2. Napipetuje se 100 µl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy

mikrozkumavky a odstřeďuje se po dobu 7 minut na 7 000 g.



3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta ve 200 µl fixačního

roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje 1

hodinu v chladícím zařízení.



4. Odstřeďuje se 7 minut při 7 000 g, odstraní se supernatant a

resuspenduje se peleta v 75 µl 0,01M PB (viz dodatek 7).



5. Kápne se 16 µl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak

ukazuje obrázek 7.1, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno

sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 µl (v 0,01 M PB).

Zbývající roztok vzorku (49 µl) může být uložen při teplotě - 20 °C po

přidání 1 objemového množství 96 % etanolu. V případě, že je třeba FISH

metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním a přidá se stejné

množství 0,01 PB (zamíchá se protřepáním).



6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo v sušičce sklíček při

teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.



V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další

den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při

pokojové teplotě.



6.1.7.2. Hybridizace



1. Dehydratují se buňky v postupné etanolové řadě 50 %, 80 % a 96 %,

pokaždé po dobu 1 minuty. Osuší se vzduchem v držáku sklíček.



2. Připraví se vlhká inkubační komora přikrytím dna vzduchotěsného boxu

tkaninou nebo filtračním papírem nasáklým hybridizační směsí (1x

hybmix, dodatek 7). Před inkubací se ohřeje box v hybridizační peci při

teplotě 45 °C po dobu nejméně 10 minut.



3. Použije se 10 µl hybridizačního roztoku (dodatek 7) na 8 okének

(okénka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; viz obr.7.1) na každém sklíčku,

přičemž dvě středová okénka (3 a 8)se nechají prázdná.



4. Přiloží se krycí sklíčka (24 x 24 mm) na první a poslední 4 okénka,

a to tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předem

zahřáté vlhké komory a nechá se proběhnout proces hybridizace po dobu 5

hodin v troubě při teplotě 45 °C v temnu.



5. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l vody s molekulární kvalitou

(Milli Q), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix a 666 ml vody s molekulární

kvalitou) a 1 l 1/8x hybmixu (42 ml 3x hybmix a 958 ml vody s

molekulární kvalitou). Nechají se inkubovat ve vodní lázni o teplotě 45

°C.



6. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku

sklíček.



7. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1

x hybmixem při teplotě 45 st. C.



8. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/8 hybmix a nechá

se inkubovat dalších 15 minut.



9. Sklíčka se krátce ponoří do UPW (např. Milli Q water) a položí na

filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu

filtračním papírem. Napipetuje se 5-10 µl krycího roztoku (např.

Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každého

okénka a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).



6.1.7.3. Hodnocení FISH testu



1. Sklíčka se ihned prohlížejí pod mikroskopem vhodným pro

epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630 x nebo 1 000 x pod

olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC)

jsou eubakteriální buňky(včetně většiny gramnegativních buněk) ve

vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro

tetramethylrhodamin-5- isothiokyanat se buňky R. solanacearum obarvené

Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s

morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně

fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (odst. 6.1.7) musí být

zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlížejí se okénka napříč

dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou

pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí

mikroskopu.



2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou

pro R. solanacearum v okénkách testovacích sklíček. Intenzita

fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního

kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují

slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.



3. Při podezření na jakoukoli kontaminaci musí být test opakován. To

může nastat v případě, kdy všechna sklíčka ve várce ukazují pozitivní

buňky z důvodu kontaminace pufru nebo jestliže jsou pozitivní buňky

zjištěny (vně okénka sklíčka) na krytu sklíčka.



4. Specifičnost testu FISH s sebou nese několik problémů. Je

pravděpodobné, že u pletiv z bramborových hlíz a pelet ze stonkových

partií bramboru dojde k výskytu populací fluorescenčních buněk na

pozadí s atypickou morfologií a ke křížové reakci se saprofytickými

bakteriemi velikostí a morfologií podobnými R. solanacearum, i když

mnohem méně častěji než u testu IF.



5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a

morfologií.



6. Interpretace výsledků testu FISH



i) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru

jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro

R. solanacearum a při použití rhodaminového filtru jasně červeně

fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou

pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně

fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet

typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk

v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují

alespoň 5 x 103 typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se

považují za pravděpodobně infikované. Nutné je další testování. Vzorky,

které obsahují méně než 5 x 103 typických buněk na 1 ml resuspendované

pelety, se považují za negativní.



ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového

filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí

a morfologií typickou pro R. solanacearum, jestliže jsou tyto typické

jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru

pozorovány v pozitivních kontrolách.



6.1.8. Testy ELISA



Princip



Testy ELISA lze použít pouze jako volitelný test kromě testů IF, PCR

nebo FISH pro jeho relativně nízkou citlivost. Při použití DAS ELISA je

obohacení a použití monoklonálních protilátek povinné. Obohacení vzorků

před použitím testu ELISA může zvýšit citlivost testu, ale může se

rovněž setkat s nezdarem kvůli konkurenci jiných organismů ve vzorku.



Poznámka:



Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se

určení titru pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako

nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování

suspense obsahující 105 až 106 buněk na 1 ml homologického kmene R.

solanacearum a použití vhodných druhotných konjugátů protilátek podle

doporučení výrobce. Při testování by měly být použity protilátky v

pracovním ředění, které je blízké nebo stejné jako u titru komerční

formulace.



Určí se titr protilátek pro suspenzi 105 až 106 buněk na 1 ml

homologického kmene R. solanacearum.



Vzorek, který byl předtím otestován jako R. solanacearum negativní a

suspenze bakterií bez vzájemného působení v solném roztoku fosfátového

pufru (PBS) se použijí jako vzorky negativní kontroly.



Jako pozitivní kontrolní vzorky se použijí alikvótní podíly vzorkových

extraktů, které byly předtím otestovány jako negativní, s příměsí 103

až 104 buněk na 1 ml biovaru 2 R. solanacearum (např. kmen NCPPB 4156 =

PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 2 A a B). Pro srovnání výsledků na

každé destičce se použije standardní suspenze 105 až 106 buněk na 1 ml

v PBS R. solanacearum. Pozitivní kontrolní vzorky musí být na

mikrotitrové destičce dobře odděleny od vzorků k testování.

Standardizované pozitivní a negativní materiály, které se používají pro

tento test, jsou uvedeny v dodatku 3 bodu A. Test kontrolního materiálu

se provede týmž způsobem jako test vzorku(ů).



Validované jsou dva protokoly ELISA.



a) Nepřímý test ELISA (Robinson Smith et al., 1995)



1) Použije se 100-200 µl vzorkového extraktu. (Zahřátí na 100 °C na 4

minuty ve vodní lázni nebo topném boxu může v některých případech

redukovat vznik nespecifických výsledků).



2) Přidá se stejné množství dvojnásobně silného uhličitanového krycího

pufru (dodatek 4) a směs se promíchá.



3) Nakape se 100 µl do každé jamky mikrotitrační destičky (např.

Nunc-Polysorp nebo rovnocenné) a nechá se inkubovat 1 hodinu při

teplotě 37 °C nebo 14 - 18 h při teplotě 4 °C.



4) Extrakty se vylijí z jamek. Jamky se třikrát vymyji pomocí PBS-Tween

(dodatek 4) a poslední vymývací roztok se nechá v jamce nejméně 5

minut.



5) Připraví se vhodné ředění protilátek proti R. solanacearum v

blokačním pufru (dodatek 4). U validovaných komerčních protilátek se

použijí doporučená ředění (obvykle dvojnásobné koncentrace, než je

titr).



6) Přidá se 100 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při

teplotě 37 °C.



7) Roztok protilátek se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím

(bod 4.).



8) Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním

pufru. Přidá se 100 µl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při

teplotě 37 °C.



9) Konjugát se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4).



10) Přidá se 100 µl substrátového alkalického roztoku fosfatázy

(dodatek 4) do každé jamky. Nechá se inkubovat v temnu při pokojové

teplotě a odečítá se absorbance při 405 nm v pravidelných 90minutových

intervalech.



b) DAS-ELISA



1) Připraví se vhodné ředění polyklonálního imunoglobulinu v

uhličitanovém pufru pH 9.6 (dodatek 4). Přidá se 200 µl do každé jamky.

Nechá se inkubovat při teplotě 37 °C 4 až 5 hodin nebo 4 ° C po dobu 16

hodin.



2) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek

4).Přidá se 190 µl extraktu ze vzorku do nejméně dvou jamek. Přidají se

rovněž pozitivní a negativní kontrolní vzorky do dvou jamek na každé

destičce. Nechá se inkubovat 16 hodin při teplotě 4 °C.



3) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).



4) Připraví se vhodné ředění specifických monoklonálních protilátek R.

solanacearum v PBS (dodatek 4) s obsahem 0,5 % hovězího sérového

albuminu (BSA), přidá se 190 µl do každé jamky a nechá stát 2 hodiny

při teplotě 37 °C.



5) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).



6) Připraví se ředění protimyšího imunoglobulinu konjugovaného

alkalickou fosfatázou v PBS. Přidá se 190 µl do každé jamky a nechá se

inkubovat 2 hodiny při teplotě 37 °C.



7) Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).



8) Připraví se roztok 1 mg p-NPP/ml alkalické fosfatázy v substrátovém

pufru (dodatek 4). Přidá se 200 µl do každé jamky a inkubuje se v temnu

při pokojové teplotě. Absorbance při 405 nm se odečítá v pravidelných

intervalech 90 minut.



Interpretace výsledků testu ELISA



Test ELISA je negativní, jestliže průměrná hodnota optické hustoty (OH)

z jamek se stejnými vzorky je menší než dvojnásobek OH u negativního

kontrolního vzorku, pokud všechny hodnoty OH pozitivních kontrolních

vzorků jsou větší než 1,0 (po 90 minutách inkubace se substrátem) a

jsou větší než dvojnásobek OH získané z negativních vzorkových

extraktů. Test ELISA je pozitivní, jestliže průměrné hodnoty OH z jamek

se stejným vzorkem jsou větší než dvojnásobek OH v negativním extraktu

testovaného vzorku, pokud hodnoty OH ve všech negativních kontrolních

vzorcích jsou menší než dvojnásobek hodnot v pozitivních kontrolních

vzorcích.



Negativní hodnoty ELISA v pozitivních kontrolních vzorcích ukazují, že

test nebyl proveden správně nebo že byl inhibován. Pozitivní hodnoty

ELISA v negativních kontrolních vzorcích ukazují, že došlo k vzájemné

kontaminaci nebo nespecifickému vázání protilátek.



6.1.9. Biotest



Poznámka.:



Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelnou

detekci 103 až 104 jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml

přidaný do extraktu ze vzorku, který byl předtím testován s negativním

výsledkem (přípravu viz v dodatku 3).



Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě

připraveného extraktu ze vzorku a v optimálních růstových podmínkách.

Metodu lze však také úspěšně použít na extrakty, které byly uchovány v

glycerolu v teplotě - 68 až - 86 °C. Následující protokol vychází z

Janseho (1988):



6.1.9.1. Použije se 10 testovacích rostlin citlivé odrůdy rajčete

(např. kultivaru Moneymaker nebo kultivaru s rovnocennou citlivostí

podle testovací laboratoře) ve fázi třech pravých listů u každého

vzorku. Podrobnosti pěstování viz. v dodatku 8. Nebo se použije lilek

(např. kultivar Black Beauty nebo kultivary s rovnocennou citlivostí),

ale jen rostliny ve fázi 2. až 3. listů až do plného rozvinu třetího

pravého listu. Příznaky u lilku jsou méně výrazné a vyvíjejí se

pomaleji. Pokud možno, doporučujeme proto použít sazenice rajčat.



6.1.9.2. Rozdělí se 100 µl extraktu ze vzorku mezi testovací rostliny.



1. Inokulace injekční stříkačkou



Inokulují se stonky rostlin hned nad děložními listy pomocí stříkačky s

podkožní jehlou (ne méně než 23G). Vzorek se rozdělí mezi testovací

rostliny.



2. Inokulace zářezem



Rostlina se přidrží mezi dvěma prsty a pipetou se kápne přibližně 5-10

µl suspendované pelety na stonek mezi děložními listy a prvním listem.



Sterilním skalpelem se udělá příčný řez asi 1 cm dlouhý a hluboký

přibližně 2/3 tloušťky stonku, přičemž řez se začne v místě kapky

resuspendované pelety.



Řez se utěsní sterilní vazelínou z injekční stříkačky.



6.1.9.3. Stejnou technikou se nainokulujte 5 sazenic vodní suspenzí 105

až 106 buněk na 1 ml, připravenou ze 48 hodinové kultury virulentního

kmene biovaru 2 R. solanacearum jako pozitivní kontrolní vzorek, a

peletovým pufrem (dodatek 4) jako negativní kontrolní vzorek. Oddělí se

pozitivní a negativní kontrolní rostliny od ostatních rostlin, aby se

zabránilo vzájemné kontaminaci.



6.1.9.4. Testovací rostliny se nechají růst v karanténním zařízení 4

týdny při teplotě 25 -30 °C a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným

zavlažováním, aby se zabránilo jak přemokření, tak vadnutí z důvodu

nedostatku vody. Aby se zabránilo kontaminaci, musí být drženy

pozitivní a negativní kontrolní rostliny ve zcela oddělených místech

skleníku nebo vegetační komory nebo jinak přísně izolovány. Musejí-li

být rostliny z různých vzorků po dobu inkubace drženy blízko sebe,

oddělí se vhodnými zástěnami. Při hnojení, zalévání, prohlížení a všech

ostatních činnostech se věnuje zvláštní pozornost tomu, aby nedošlo k

vzájemné kontaminaci. Nutné je udržovat skleník nebo vegetační prostor

bez hmyzích škůdců, protože by mohli přenést bakterie mezi vzorky.



Hledají se příznaky vadnutí, epinastie, chloróz anebo krnění rostlin.



6.1.9.5. Z infikovaných rostlin se provede izolace (odst. 2.3) a

identifikují se podezřelé čisté kultury (bod 6.2.).



6.1.9.6. Jestliže během 3 týdnů nejsou pozorovány žádné příznaky,

provede se test IF/PCR/izolace na složeném vzorku ze segmentů stonků

dlouhých 1 cm z každé testovací rostliny, odebraných nad místem

inokulace. Je-li test pozitivní, provedou se zřeďovací roztěry (bod

4.1).



6.1.9.7. Identifikují se všechny čisté kultury s podezřením na R.

solanacearum (bod 6.2.).



Interpretace výsledků biotestu



Platné výsledky biotestu jsou získány, jestliže pozitivní kontrolní

testovací rostliny vykazují typické příznaky, bakterie mohou být z

těchto rostlin znovu izolovány a negativní kontrolní rostliny

nevykazují žádné příznaky. Biotest je negativní, jestliže rostliny

nejsou infikovány bakteriemi R. solanacearum, pokud byl organismus

zjištěn u pozitivních kontrolních testovacích rostlin. Biotest je

pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikovány bakteriemi R.

solanacearum.



6.2. Identifikační testy



Identifikují se čisté kultury izolovaného podezřelého organismu R.

solanacearum použitím nejméně dvou následujících testů založených na

různých biologických principech. Zahrnou se případně známé referenční

kmeny pro každý provedený test (viz dodatek 3).



6.2.1. Výživové a enzymatické identifikační testy Určují se následující

fenotypové vlastnosti, které jsou vesměs přítomny nebo naopak chybí u

R. solanacearum, metodami Lelliott a Stead (1987), Klement et al.

(1990), Schaad (2001).

Text Očekávaný výsledek



Produkce fluorescenčního pigmentu -

Inkluze PHB +

Oxidačně fermentační test O+/F-

Katalázová aktivita +

Oxidázový test podle Kovacse +

Redukce dusičnanů +

Využití citrátů +

Růst při 40 st. C -

Růst v 1% NaCl +

Růst v 2% NaCl -

Arginin-dihydrolázová aktivita -

Ztekucení želatiny -

Hydrolýza škrobu -

Hydrolýza eskulinu -

Produkce levanu -





Média a metody viz. Lelliot &Stead (1987).



6.2.2. Test IF



6.2.2.1. Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na 1 ml v pufru IF

(dodatek 4).



6.2.2.2. Připraví se řada dvojnásobných zředění vhodného antiséra.



6.2.2.3. Použije se IF metoda (6.1.5.).



6.2.2.4. Test IF je pozitivní, jestliže titr IF kultury odpovídá titru

pozitivní kontroly.



6.2.3. Test ELISA



Poznámka:



Při provádění pouze 2 identifikačních testů se nepoužívá kromě této

metody jiný sérologický test.



6.2.3.1. Připraví se suspenze přibližně 108 buněk na 1 ml v 1X PBS

(dodatek 4).



6.2.3.2. Provede se test ELISA se specifickou monoklonální protilátkou

k R. solanacearum.



6.2.3.3. Test ELISA je pozitivní, jestliže hodnota jeho výsledku

získaná z této kultury je nejméně poloviční v porovnání s hodnotou z

pozitivní kontroly.



6.2.4. Testy PCR



6.2.4.1. Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na 1 ml sterilní vody

(UPW = ultra pure water).



6.2.4.2. Ohřeje se 100 µl buněčné suspense v uzavřených zkumavkách v

ohřívacím bloku nebo vařící vodní lázni při 100 °C 4 minuty. Vzorky

mohou být uchovány při teplotě - 16 až - 24 °C do dalšího použití.



6.2.4.3. Použijí se příslušné postupy PCR k amplifikaci amplikonů

specifických pro R. solanacearum (např. Seal et al. (1993); Pastrik a

Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et

al. (1997), Weller et al. (1999).



6.2.4.4. Identifikace organismu R. solanacearum je pozitivní, jestliže

amplikony PCR mají stejnou velikost a mají stejnou mnohotvárnost délky

fragmentů jako pozitivní kontrolní kmen.



6.2.5. Test FISH



6.2.5.1. Připraví se suspenze přibližně 106 buněk na 1 ml v UPW.



6.2.5.2. Použije se metoda FISH (6.1.7) s nejméně 2 oligosondami

specifickými pro R. solanacearum (dodatek 7).



6.2.5.3. Test FISH je pozitivní, jestliže se u kultury a pozitivní

kontroly dosáhne stejných reakcí.



6.2.6. Analýza mastných kyselin (FAP)



6.2.6.1. Pěstuje se kultura na tryptikázo- sójovém agaru (Oxoid) 48

hodin při teplotě 28 °C.



6.2.6.2. Použijte se metoda FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).



6.2.6.3. Test FAP je pozitivní, jestliže je profil podezřelé kultury

stejný jako profil pozitivní kontroly. Výskyt charakteristických

mastných kyselin: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absence

16:0 3 OH poukazuje na Ralstonia sp.



6.2.7. Metody charakteristiky kmenů



Pro každý nový případ izolace R. solanacearum se doporučuje

charakteristika kmenu použitím jedné z následujících metod. U každého

provedeného testu se zahrnou případně známé referenční kmeny (viz.

dodatek 3).



6.2.7.1. Stanovení biovaru



R. solanacearum tvoří biovary lišící se schopností využití a/nebo

oxidace tří disacharidů a tří hexosových alkoholů (Hayward, 1964 a

Hayward et al., 1990). Živná půda pro test biovaru je popsána v dodatku

2. Test lze úspěšně provést očkováním do živné půdy s čistou kulturou

R. solanacearum a inkubací při teplotě 28 °C. Je-li živná půda

rozdělena na sterilní destičky s 96 jamkami (200 µl na 1 jamku),

zbarvení se mění během 72 hodin od olivově zelené po žlutou a znamená

pozitivní výsledek testu.



6.2.7.2. Genomická variabilita



Molekulární identifikace kmenů komplexu R. solanacearum lze dosáhnout

několikerými technikami, mezi něž patří:



1. Analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů RFLP (Cook et

al., 1989).



2. Repetitivní sekvenční PCR s využitím primerů REP, BOX a ERIC (Louws

et al., 1995; Smith et al., 1995).



3. Analýza délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů AFLP (Van

der Wolf et al., 1998).



6.2.7.3. Metody PCR



Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít

k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a

skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně

definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA

(Taghavi et al., 1996).



6.3. Konfirmační test (test patogenity)



Jako závěrečné potvrzení diagnózy R. solanacearum a k potvrzení

virulence kultur identifikovaných jako R. solanacearum musí být

proveden test patogenity.



1) Připraví se inokulum o hustotě přibližně 106 buněk na 1 ml ze 24 až

48 hodinových kultur k testování a příslušný kmen pozitivní kontroly R.

solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3).



2) Inokuluje se 5 až 10 náchylných sazenic rajčete nebo lilku ve fázi 3

pravých listů (viz odst. 6.1.9).



3) Sazenice se nechají inkubovat až 2 týdny při teplotě 25-28 °C a

vysoké relativní vzdušné vlhkosti s přiměřeným zaléváním, bez vystavení

zamokření nebo vyprahlosti půdy. U čistých kultur by typické vadnutí

mělo nastat během 14 dnů. Neobjeví-li se po této době příznaky, kultura

nemůže být považována jako patogenní forma R. solanacearum.



4) Hledají se příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy nebo krnění.



5) Provede se izolace z rostlin vykazujících příznaky odebráním

segmentu ze stonku asi 2 cm nad místem inokulace. Segment se rozmělní a

suspenduje v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM

fosfátového pufru (dodatek 4). Izolace ze suspense se provede

zřeďovacím roztěrem pokud možno na selektivní živné půdě (dodatek 2).

Po inkubaci 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C se vyhodnotí výskyt

typických kolonií pro R. solanacearum.



Dodatek 1



Laboratoře podílející se na optimalizaci a validaci protokolů

------------------------------------------------ ----------------------------------

Laboratoř (1) Místo Země

------------------------------------------------ ----------------------------------

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Vídeň a Linec Rakousko



Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgie



Plantedirektoratet Lyngby Dánsko



Central Science Laboratory York Anglie



Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Skotsko

Laboratoire National de la Protection Végétaux,



Unité de Bactériologie Angers Francie



Laboratoire National de la Protection Végétaux,

Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francie



Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Německo



Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Německo



State Laboratory Dublin Irsko



Dipartimento di Scienze e Tecnologie



Agroambientali Boloň Itálie

Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi



Fitosanitari Verona Itálie



Nederlandse Algemene Keuringsdienst Emmeloord Nizozemsko



Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nizozemsko



Direcçao-General de Protecçao das Culturas Lisabon Portugalsko



Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca Španělsko



Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias Valencie Španělsko



Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala Švédsko

------------------------------------------------ ----------------------------------

(1) Kontakty: viz internetová stránka

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main





Dodatek 2



Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum



a) Živné půdy pro izolaci a kultivaci



Živný agar (NA)

Živný agar (Difco) 23,0 g

Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)

Kvasnicový extrakt (Difco) 5,0 g

Bacto-Pepton (Difco) 5,0 g

D(+) Glukóza (monohydrát) 10,0 g

Bacto-Agar (Difco) 15,0 g

Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Sacharózopeptonový agar (SPA)

Sacharóza 20,0 g

Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g

K2 HPO4 0,5 g

MgSO4 . 7H2O 0,25 g

Bacto-Agar (Difco) 15,0 g

Destilovaná voda 1,00 l

pH 7,2-7,4

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Kelmanovo tetrazoliové médium

kasein hydrolyzát (Difco) 1,0 g

Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g

Dextróza 5,0 g

Bacto-Agar (Difco) 15,0 g

Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný

roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do

dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.



b) Validované selektivní živné půdy



Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)



Základní živná půda

Casamino kyseliny (Difco) 1,0 g

Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g

Glycerol 5,0 ml

Bacto-Agar (Difco) (viz pozn. 2) 15,0 g

Destilovaná voda 1,00 l

Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný

vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená

konečná koncentrace:



Krystalová violeť (Sigma) 5 mg/l

Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004) 600 000 U (přibližně 100 mg)/l

Bacitracin (Sigma B-0125) 1 250 U (přibližně 25 mg)/l

Chloramfenikol (Sigma C-3175) 5 mg/l

Penicilín-G (Sigma P-3032) 825 U (přibližně 0,5 mg)/l

2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma) 50

mg/l



Poznámky:



1. Použití jiných než výše uvedených reagencí může ovlivnit růst R.

solanacearum.



2. Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1. V takovém

případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to také omezit

růst konkurenčních saprofytů. Typické kolonie R. solanacearum se mohou

tvořit o 1-2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a

rozptýlenější než při použití Bacto-Agaru.



3. Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2 500 U/l může omezit populace

konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.



Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a

musí se spotřebovat do 1 měsíce.



Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.



Nutno zabránit přílišnému vysušení média. Každá nově připravená šarže

živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem

suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a

pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické

kolonie.



c) Validované obohacené živné půdy



Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996) Provede se příprava jako pro

selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a

2,3,5- trifenyltetrazolium chlorid.

Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)

Sacharóza 10 g

Proteázový pepton 5 g

K2 HPO4 0,5 g

MgSO4 0,25 g

NaNO3 0,25 g

Destilovaná voda 1,00 l



Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na50 °C.



Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.





Dodatek 3



A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál



a) Izolované bakteriální kultury Následující izolované bakteriální

kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k

pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se

zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně

dostupné a lze je získat z těchto sbírek:



1. Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední

vědecká laboratoř York, UK.



2. Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.



3. Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav

fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.

Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum

-------------------------------------------------------- --------------------------

Kód NCPPB SMT

# Jiné kódy Země původu Biovar

-------------------------------------------------------- --------------------------

NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Egypt 2

NCPPB 4154 10 CFBP 4585, 550, EURS21 Turecko 2

NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Anglie 2

NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Kypr 2

NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Švédsko 2

NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Belgie 2

NCPPB 4156 (*) 71 (*) PD 2762, CFBP 3857 Nizozemsko 2

NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Francie 2

NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS80 Portugalsko 2

NCPPB 4160 69 IVIA-1632-2 Španělsko 2

NCPPB 4161 76 B3B Německo 2

NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 USA 1

NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Kostarika 1

NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310,

SEQ205 Kolumbie 2

NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Peru 2T

NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Brazílie 2T

NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72,

SEQ225 Peru 3

NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49,

HAY0131 Austrálie 3

NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121,

CMIb2861 Srí Lanka 4

NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Filipíny 4

NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 Čína 5

-------------------------------------------------------- --------------------------

(*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum

biovar 2 (rod 3).



Poznámka:



Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že

pocházejí z původních sbírek kultur.

Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky

příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů

-------------------------------------- --------------------------------------

Kód NCPPB SMT

# Jiné kódy Identifikace

-------------------------------------- --------------------------------------

NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa (1)

NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis

pv. marginalis (1)

NCPPB 4164 - CFBP 2227 Burkholderia cepacia (2)

NCPPB 4165 - CFBP 2459 Ralstonia pickettii (2)

NCPPB 4166 58 CFBP 3567,

CSL Pr1150 Ralstonia pickettii (1)

NCPPB 4167 60 CFBP 4618,

PD 2778 Ralstonia sp. (1)

NCPPB 1127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis (1)

NCPPB 353 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli (1)

NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia (1)

NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae (1)

NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii (1)

NCPPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3)

NCPPB 4168 61 CFBP 4619,

IPO S339 Enterobacter sp. (1)

NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp. (1)

NCPPB 4170 63 CFBP 4621,

IPO S306 Ochrobactrum anthropi (1) (2)

NCPPB 4171 64 CFBP 4622,

IPO 1693 Curtobacterium sp. (1) (2)

NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp. (1)

NCPPB 4173 - PD 2318 Aureobacterium sp. (2)

NCPPB 4174 81 IVIA 1844.06 Flavobacterium sp. (1) (2)

-------------------------------------- --------------------------------------



(1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF

a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem.



(2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt

PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití

specifických primerů OLI-1 a Y- 2 (viz dodatek 6).



(3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám

pouze u banánů v Indonésii.



b) Komerční standardizovaný kontrolní materiál



Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky

kultur NCPPB.



Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz

bramboru k negativní kontrole všech testů. Mražené sušené pelety

bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 103 až

104 a 104 až 106 buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD

2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů.

Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto

vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity. Ve

formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB

4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 106 buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole

sérologických testů.



B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy

vodivých pletiv PCR/IF a FISH



Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy

3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné

půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná

hustota přibližně 2 × 108 buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se

jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15

při 600 nm.



Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou

slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum. Zpracují se

pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.



Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 µl

resuspendované pelety.



Přenese se 100 µl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a

protřepe se..



Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.



Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní

vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní

negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.



Připraví se alikvotní části z 100 µl ve sterilních zkumavkách o objemu

1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se

při teplotě - 16 až - 24 °C až do doby použití.



Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly

být nejprve potvrzeny testem IF.



Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních

kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.



Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a

negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.



Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum

zjištěna v nejméně v 106 a 10 4 buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí

být zjištěn v žádné z negativních kontrol.



Dodatek 4



Pufry pro testovací postupy



OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry lze skladovat po dobu až jednoho

roku.



1. Pufry pro extrakci



1.1 Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)



Tento pufr se používá k extrakci bakterie z rostlinných tkání

homogenizací nebo protřepáním.

Na2 HPO4 (bezvodý) 4,26 g

KH2PO4 2,72 g

Destilovaná voda 1,00 l



Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C

po dobu 15 min.



Užitečné mohou být následující složky:

Účel Množství (na litr)



Lubrolové vločky Protisrážlivý prostředek (*) 0,5 g

DC silikonový odpěňovač Odpěňovací činidlo (*) 1,0 ml

Tetrasodiumpyrofosfát Antioxidační činidlo 1,0 g

Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP - 40) Vázání inhibitorů PCR 50 g

---------------------------------------

(*) pro použití při extrakci homogenizací



1.2. Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)



Tento pufr se používá pro resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků z

pupkových částí bramborových hlíz poté, co byly odstřeďováním

koncentrovány do pelety.

Na2HPO4 .12H2O 2,7 g

NaH2PO4 . 2H2O 0,4 g

Destilovaná voda 1,00 l



Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C

po dobu 15 min.



2. Pufry pro IF test



Pufr pro IF (10 mM fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS), pH

7,2)



Tento pufr se používá k ředění protilátek.



Na2HPO4 .12H2O 2,7 g

NaH2PO4 . 2H2O 0,4 g

NaCl 8,0 g

Destilovaná voda 1,00 l



Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje v autoklávu při 121 °C

po dobu 15 min.



IF-pufr-Tween



Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček. Přidá se 0,1 %

Tween 20 k pufru pro IF.



Fosfátový pufr v glycerolu, pH 7,6



Tento pufr se používá jako krycí roztok na okénka sklíček na IF testy k

zvýšení fluorescence.

Na2HPO4 .12H2O 3,2 g

NaH2PO4 . 2H2O 0.15 g

Glycerol 50 ml

Destilovaná voda 100 ml





Krycí roztoky jsou komerčně dostupné, např. Vectashield® (Vector

Laboratories) nebo Citifluor(R) (Leica).



3. Pufry pro účely nepřímého testu ELISA



3.1. Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.

Na2CO3 6,36 g

NaH CO3 11,72 g

Destilovaná voda 1,00 l



Rozpustí se složky, zkontroluje pH a steriluje autoklávováním při

teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako

antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).



3.2. Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10 x

PBS), pH 7,4

NaCl 80,0 g

KH2PO4 2,0 g

Na2HPO4 . 12H2O 29,0 g

KCl 2,0 g

Destilovaná voda 1,00 l



3.3. PBS-Tween

10 x PBS 100 ml

10 % Tween 20 5 ml

Destilovaná voda 895 ml



3.4. Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).



10 x PBS 10,0 ml

Polyvinylpyrrolidon-44000

(PVP-44) 2,0 g

10 % Tween 20 0,5 ml

Sušené mléko 0,5 g

Destilovaná voda doplnit do 100 ml



3.5. Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8

Diethanolamin 97 ml

Destilovaná voda 800 ml





Rozpustí se a koncentrovanou HCl se upraví pH na 9,8.



Doplní se do 1 l destilovanou vodou.



Přidá se 0,2 g MgCl2.



Rozpustí se dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml

roztoku.



4. Pufry pro účely testu DASI ELISA



4.1. Potahovací pufr, pH 9,6.



Na2CO3 1,59 g

NaH CO3 2,93 g

Destilovaná voda 1 000 ml



Rozpustí se složky a zkontroluje pH 9,6.



4.2. 10 x fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2- 7,4

NaCl 80,0 g

Na2HPO4 .12H2O 27 g

NaH2PO4 . 2H2O 4 g

Destilovaná voda 1 000 ml



4.3. PBS-Tween

10 x PBS 50 ml

10 % Tween 20 5 ml

Destilovaná voda 950 ml



4.4 Substrátový pufr, pH 9,8

Diethanolamin 100 ml

Destilovaná voda 900 ml



Smíchá se a nastaví se hodnota pH 9,8 koncentrovanou HCl.



Dodatek 5



Stanovení koncentrace IF a FISH pozitivních buněk



1. Vypočítá se průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom

pozorovacím poli (c).



2. Vypočítá se počet typických fluoreskujících buněk v okénku

mikroskopického sklíčka (C).



C = c x S/s,



kde S = plocha jednoho pole na sklíčku s více okénky a



s = plocha pole objektivu.



s = píi2/4G2K 2,



kde i = koeficient pole (v rozmezí 8 - 24 podle typu okuláru),



K = tubusový koeficient (1 nebo 1,25),



G = zvětšení objektivu (100 x, 40 x atd.).



3. Vypočítá se počet charakteristických fluoreskujících buněk na 1 ml

resuspendované pelety (N).



N =C x 1 000/y x F,



kde y = objem resuspendované pelety v každém okénku a



F = zřeďovací faktor resuspendované pelety



Dodatek 6



Validované protokoly a činidla pro PCR



Poznámka:



Úvodní testování by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění nejméně 103

až 104 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu. Úvodní

testování by také nemělo vykazovat žádné falešné pozitivní výsledky se

skupinou vybraných kmenů bakterií (viz dodatek 3).



1. Protokol PCR Seal et al. (1993)



1.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'

Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'



Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp



1.2. Reakční směs PCR

Reagencie Množství v reakci Konečná koncentrace

Sterilní UPW 17,65 µl

10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2 ) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)

Směs dNTP (20mM) 0,25 µl 0,2 mM

Primer OLI-1 (20 µM) 1,25 µl 1µM

Primer Y-2 (20 µM) 1,25 µl 1µM

Taq polymerasa (5U/µl)(1) 0,1 µl 0,5 U

Množství vzorku 2,0 µl

Celkové množství 25 µl





(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer

(AmpliTaq) a Gibco BRL.



1.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus: i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)

35 cyklů: ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)

iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)

iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)

1 cyklus: v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)

vi) ponechá se při teplotě 4 °C.



Poznámka:



Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer

9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků

cyklu ii), iii) a iv).



1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.



Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí

polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci

při teplotě 37 °C.



2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)



2.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g - 3'

Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3'





Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553

bp.



2.2. Reakční směs PCR



Reagencie Množství v reakci Konečná koncentrace



Sterilní UPW 16,025 µl

10x pufr PCR (1) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakce V) (10 %) 0,25 µl 0,1 %

Směs dNTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM

Primer Ps-1 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM

Primer Ps-2 (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM

Taq polymerasa (5U/µl)(1) 0,1 µl 0,5 U

Množství vzorku 5,0 µl

Celkové množství 25,0 µl



(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer

(AmpliTaq) a Gibco BRL.



Poznámka:



Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s

polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou

být rovněž použity ve stejných koncentracích.



2.3 Reakční podmínky PCR



Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)

35 cyklů: ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)

iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)

iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)

1 cyklus: v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)

vi) ponechá se při teplotě 4 °C.



Poznámka:



Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research

PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu

jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).



2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu



Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí

zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po

inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty

specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.



3. Protokol pro multiplexní PCR s interní kontrolou (Pastrik et al.,

2002)



3.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer RS-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Reverzní primer RS-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Přímý primer NS-5-F: 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'

Reverzní primerNS-6-R: 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'





Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 718 bp

(sada primerů RS).



Očekávaná velikost amplikonu interní kontroly PCR 18S rRNA = 310 bp

(sada primerů NS).



3.2. Reakční směs PCR

Reagencie Množství v reakci Konečná koncentrace



Sterilní UPW 12,625 µl

10x pufr PCR (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakce V) (10 %) 0,25 µl 0,1 %

Směs dNTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM

Primer RS-1-F (10 µM) 2,0 µl 0,8 µM

Primer RS-1-R (10 µM) 2,0 µl 0,8 µM

Primer NS-S-F (10 µM) (2) 0,15 µl 0,06 µM

Primer NS-6-R (10 µM) (2) 0,15 µl 0,06 µM

Taq polymeráza (5U/µl)(1) 0,2 µl 1,0 U

Množství vzorku 5,0 µl

Celkové množství 25,0 µl



-----



(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer

(AmpliTaq) a Gibco BRL.



(2) Koncentrace primerů NS-5-F a NS-6-R byly optimalizovány pro

výkrojky pletiva pupkových částí hlíz bramboru pomocí homogenizační

metody a purifikace DNA podle Pastrika (2000) (viz 6.1.6.1.a)). Použití

extrakční metody třepáním nebo jiných metod izolace DNA může vyžadovat

nové provedení optimalizace koncentrací reagencií.



3.3. Reakční podmínky PCR



Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus: i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)

35 cyklů: ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)

iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)

iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)

1 cyklus: v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)

vi) nechá se při teplotě 4 °C.



Poznámka:



Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research

PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých

kroků cyklu ii), iii) a iv).



3.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu



Produkty PCR vzniklé amplifikací z DNA R. solanacearum vytvářejí

zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Bsm I

nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po inkubační době 30 minut při

teplotě 65 °C.



4. Protokol PCR specifický pro biovar R. solanacearum (Pastrik et al,

2001)



4.1. Oligonukleotidové primery



Přímý primer Rs-1-F: 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'

Reverzní primer Rs-1-R: 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'

Reverzní primer Rs-3-R: 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'



Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum:



s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp







4.2. Reakční směs PCR



a) Protokol PCR specifický pro biovar 1



Reagencie Množství v reakci Konečná koncentrace



0Sterilní UPW 12,925 µl

10x pufr PCR (1) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakce V) (10 %) 0,25 µl 0,1 %

Směs dNTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 µM) 2,0 µl 0,8 µM

Primer Rs-1-R (10 µM) 2,0 µl 0,8 µM

Taq polymeráza (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U

Množství vzorku 5,0 µl

Celkové množství 25,0 µl



(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer

(AmpliTaq) a Gibco BRL.



b) Protokol PCR specifický pro Biovar 3/4/5

Reagencie Množství v reakci Konečná koncentrace

Sterilní UPW 14,925 µl

10x pufr PCR (1) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakce V) (10 %) 0,25 µl 0,1 %

Směs dNTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 µM) 1,0 µl 0,4 µM

Primer Rs-3-R (10 µM) 1,0 µl 0,4 µM

Taq polymeráza (5U/µl)(1)0,2 µl 1,0 U

Množství vzorku 5,0 µl

Celkové množství 25,0 µl



----



(1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer

(AmpliTaq) a Gibco BRL.



4.3. Reakční podmínky PCR



Provede se následující cyklický proces pro obě reakce specifické pro

biovary 1/2- a biovary 3/4/5:

1 cyklus: i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)

35 cyklů: ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)

iii) 30 sekund při 58 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)

iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)

1 cyklus: v) 5 minut při 72 °C (konečná syntéza)

vi) ponechá se při teplotě 4 °C.



Poznámka:



Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research

PTC 200. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých

kroků cyklu ii), iii) a iv).



4.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.



Produkty PCR vzniklé amplifikací DNA R. solanacearum pomocí primerů

Rs-1-F a Rs-1-R vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních

fragmentů s enzymem Bsm I nebo Isoschizomere (např. Mva 1269 I) po

inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Produkty PCR vzniklé

amplifikací z DNA R. solanacearum pomocí primerů Rs-1-F a Rs-3-R nemají

žádná restrikční místa.



5. Příprava nanášecího pufru



5.1. Bromfenolová modř (10 % zásobní roztok)

Bromfenolová modř 5 g

Destilovaná (redestilovaná) voda 50 ml



5.2. Nanášecí pufr

Glycerol (86 %) 3,5 ml

Bromfenolová modř (5,1) 300 µl

Destilovaná (redestilovaná) voda (bidestilát) 6,2 ml



6. Pufr 10x TRIS-acetát-EDTA (TAE), pH 8,0

TRIS 48,4 g

Ledová kyselina octová 11,42 ml

EDTA (sodná sůl) 3,72 g

Destilovaná voda 1,00 l



Před použitím se zředí na 1X.



Také komerčně dostupné (např. Invitrogen nebo rovnocenné).



Dodatek 7



Validovaná činidla pro FISH test



1. Oligosondy



Sonda specifická pro R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct

acc ccc-3'



Nespecifická eubakteriální sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg

agt-3'



2. Fixační roztok



[UPOZORNĚNÍ: FIXAČNÍ ROZTOK OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTERÝ JE TOXICKÝ.

POUŽÍT RUKAVICE A NEVDECHNOUT. DOPORUČUJE SE PRACOVAT V DIGESTOŘI.]



i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody (např. Ultra pure water =

(UPW)) na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu.

Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání

magnetickým míchadlem.



ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH

7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v

případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. [UPOZORNĚNÍ: V

ROZTOCÍCH S PARAFORMALEDHYDEM NEPOUŽÍVAT MĚŘIČ PH!]



iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 µm a skladuje se

chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.



3. 3x Hybmix

NaCl 2,7 M

Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)



EDTA (sterilizovaný přes filtr a autoklávovaný) 15 mM Zředí se až 1x,

podle potřeby.



4. Hybridizační roztok

1x Hybmix

Sodium dodecyl sulfát (SDS) 0,01 %

Formamid 30 %

Sonda EUB 338 5 ng/µl

Sonda OLI-1 nebo OLI2 5 ng/µl



Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1.

Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 µl

hybridizačního roztoku.UPOZORNĚNÍ: FORMAMID JE VELMI JEDOVATÝ, NUTNO

POUŽÍVAT RUKAVICE A UČINIT POTŘEBNÁ BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ!

Tabulka 1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi

------------------------------ ----------------------------------------

Počet sklíček 1 4 6 8 10

------------------------------ ----------------------------------------

Sterilní ultra čistá voda 23,1 92,4 138,6 184,8 231,0

3 x Hybmix 30,0 120,0 180,0 240,0 300,0

1 % SDS 0,9 3,6 5,4 7,2 9,0

Formamid 27,0 108,0 162,0 216,0 270,0

Sonda EUB 338 (100 ng/µl) 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0

Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/µl)4,5 18,0 27,0 36,0 45,0

------------------------------ ----------------------------------------

Celkové množství 90,0 360,0 540,0 720,0 900,0

------------------------------ ----------------------------------------



Poznámka:



Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v

temnu při teplotě - 20 °C. Během použití se chrání před přímým

slunečním zářením nebo elektrickým světlem.



5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0

Na2HPO 48,52 g

KH2 PO4 5,44 g

Destilovaná voda 1,00 l



Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při

teplotě 121 °C po dobu 15 minut.



Dodatek 8



Pěstování lilku a rajčete



Vysejí se semena rajčete (Lycopersicon esculentum) nebo lilku (Solanum

melongena) do pasterizovaného výsevního substrátu. Sazeničky s plně

rozvinutými děložními lístky (10 až 14 dní) se přesadí do

pasterizovaného pěstebního substrátu. Rostliny lilku a rajčete by se

měly pěstovat ve skleníku za následujících podmínek:

Délka dne: 14 hodin nebo přirozená délka dne, pokud je delší;

Teplota: den: 21 až 24 °C,

noc: 14 až 18 °C.





Vhodná odrůda lilku vejcoplodého: "Black Beauty"



Vhodná odrůda rajčete: "Moneymaker"



Dodavatelé: viz internetová stránka

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.



LITERATURA



1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990.

Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative,

phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol.

172: 762-770.



2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the

control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official

Journal of the European Communities L235, 1-39.



3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999.

Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and

application to the identification of European isolates. European

Journal of Plant Pathology 105;373-380.



4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and

Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal

Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in

Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68,

3634-3638.



5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of

Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length

polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the

hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions

1:113-121.



6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996.

Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber

extracts. EPPO Bulletin 26; 663- 678.



7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for

the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C.

Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for

International Agricultural Research, Canberra, Australia.



8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum.

Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.



9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990.

Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum.

Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.



10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya- Iwaki, S.

Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia

solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique.

J. Phytopathology 146; 379-384.



11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum

in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and

specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.



12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of

Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis.

Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.



13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas

solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium.

Phytopathology 44; 693-695.



14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in

Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.



15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of

bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd.,

Oxford. 216 pp.



16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B.,

Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation,

serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In:

H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.



17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J.,

1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and

Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences

and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.



18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J.

1995. Differentiation of genomic structure by rep- PCR fingerprinting

to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria.

Phytopathology 85; 528-536.



20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in

potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148;

619-626.



19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R.

Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W.

Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species

and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying

Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac.

J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.



21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence

analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR

amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with

internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108,

831-842.



22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D.

(1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the

causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7,

67-79.



23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant

pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373

pp.



24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993.

Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas

pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing:

construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by

polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.



25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995.

Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas

solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology

61; 4262-4268.



26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other

Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International

Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.



27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of

the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum,

Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on

16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic

Bacteriology 46; 10-15.



28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M.,

Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A.,

Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3

in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In:

Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease:

Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.



29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and

Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an

automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay.

Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.



30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L.

Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot

of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted

probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.



Příloha 2



A. Rozsah informace o provedeném průzkumu výskytu původce

kroužkovitosti a původce hnědé hniloby podle § 3 odst. 11



Informace o provedeném průzkumu výskytu původce kroužkovitosti a

původce hnědé hniloby podle § 3 odst. 11 obsahuje:



a) při zjišťování výskytu původce kroužkovitosti a původce hnědé

hniloby v porostech, ve skládkách a v zásilkách bramboru:



- rozdělení na rozmnožovací materiál^1) (rozdělení podle kategorií) a

ostatní brambory (rozdělení na brambory pro konzumní a průmyslové

účely),



– celková plocha pěstování sadbových a ostatních brambor v hektarech,



- počet a výměra prohlédnutých a vzorkovaných porostů v hektarech,



- počet prohlédnutých a vzorkovaných partií v ČR sklizených nebo do ČR

dovezených hlíz,



- doba odběru a počet vzorků odebraných z porostů brambor, skládek a

zásilek sklizených hlíz a výsledky testování;



b) při zjišťování výskytu původce hnědé hniloby v porostech rajčete:



- počet kontrolovaných podniků,



- počet kontrol a prohlédnutých rostlin (i odhad),



- počet odebraných vzorků a výsledky testování;



c) při zjišťování výskytu původce hnědé hniloby v porostech jiných

hostitelských rostlin než je brambor a rajče, včetně hostitelských

rostlin z čeledi lilkovitých v pobřežní vegetaci:



- počet kontrolovaných podniků, druh a počet (i odhad) prohlédnutých

rostlin,



- počet odebraných vzorků rostlin, druh provedených testů a výsledky

testování,



- počet a označení vodních útvarů, odkud byly odebírány vzorky rostlin;



d) při zjišťování výskytu původce hnědé hniloby ve vodních zdrojích

používaných k závlaze hostitelských rostlin a v odpadních vodách z

podniků, které průmyslově zpracovávají brambory:



- počet a označení vodních útvarů a počet podniků, odkud byly odebrány

vzorky vody,



- počet odebraných vzorků vody, doba odběru, druh provedených testů a

výsledky testování;



B. Uchování testovaných vzorků a partií a dokladování testování



1. Vznikne-li podezření z výskytu původce kroužkovitosti nebo hnědé

hniloby na základě pozitivního výsledku testování provedeného postupy

podle přílohy č. 1, musí být až do potvrzení nebo vyvrácení tohoto

výsledku dalším postupem podle přílohy č. 1 uchovány a vhodným způsobem

konzervovány:



- celá partie rostlin, z níž byl odebrán vzorek, nebo část této partie

v původním obalu s etiketou, je-li to možné,



- všechny hlízy a pokud možno i rostliny odebraného vzorku,



- jakýkoliv zbývající extrakt a dodatečně připravený materiál pro

screeningový(é) test(y), např. sklíčka pro imunofluorescenční test, a



- všechny příslušné podklady



Uchování hlíz umožní případné testování odrůdové pravosti anebo použít

jinou metodu testování.



2. V případě potvrzení výskytu původce kroužkovitosti nebo hnědé

hniloby musí být minimálně po dobu jednoho měsíce od úředního oznámení

výsledku testu způsobem stanoveným v § 5 odst. 3 uchovány a vhodným

způsobem konzervovány:



- materiál specifikovaný v bodě 1,



- vzorek infikovaných rostlin lilku vejcoplodého nebo rajčete

naočkovaných extraktem z hlíz nebo rostlin (v případě hnědé hniloby,

kde je to vhodné), a



- izolovaná kultura původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby.



----------------



1) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu

osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění

pozdějších předpisů.



Příloha 3



Způsob provádění odborného šetření a stanovení rozsahu pravděpodobného

zamoření původcem kroužkovitostií nebo původcem hnědé hniloby a rozsahu

jejich možného rozšíření a náležitosti oznámení potvrzeného výskytu

původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby



1. Odborné šetření podle § 5 odst. 1 písm. b) je zaměřeno na:



- místo produkce,



v němž byly nebo jsou pěstovány rostliny bramboru, jež jsou klonově

příbuzné s rostlinami partie bramboru, ve které bylo potvrzeno zamoření

původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby,



v němž byly nebo jsou pěstovány rostliny rajčete původem z téže partie

osiva nebo sadby rajčete jako rostliny, v nichž bylo potvrzeno zamoření

původcem hnědé hniloby,



v němž byly nebo jsou pěstovány rostliny bramboru, a v případě původce

hnědé hniloby také rajčete, jež byly z důvodu podezření na výskyt

původce kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podrobeny odbornému

šetření podle § 4 odst. 3,



v němž byly nebo jsou pěstovány rostliny bramboru, a v případě původce

hnědé hniloby také rajčete, a které leží v sousedství zamořeného místa

produkce, včetně místa produkce, kde byly společně nebo prostřednictvím

společného smluvního partnera použity zemědělské stroje nebo zařízení,

na němž byla k závlaze nebo postřiku použita povrchová voda ze zdroje u

něhož bylo potvrzeno, že je zamořeno původcem hnědé hniloby nebo které

je ze zamoření původcem hnědé hniloby podezřelé,



– na němž byla k závlaze nebo postřiku použita povrchová voda ze

zdroje, u něhož bylo potvrzeno, že je zamořen původcem hnědé hniloby

nebo který je ze zamoření původcem hnědé hniloby podezřelý,



které bylo nebo je zaplaveno povrchovou vodou zamořenou původcem hnědé

hniloby nebo povrchovou vodou z tohoto zamoření podezřelou,



a



- povrchovou vodu, která byla použita k závlaze nebo postřiku pozemku

nebo místa produkce, u nichž bylo potvrzeno, že jsou zamořeny původcem

hnědé hniloby, nebo která tato pole nebo místa produkce zaplavila.



2. Při stanovení rozsahu pravděpodobného zamoření původcem

kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby podle § 5 odst. 1 písm. b) je

nutno posoudit zejména:



- hostitelské rostliny pěstované v místě produkce, označeném za

zamořené podle § 5 odst. 1 písm. a),



- místo produkce nebo prostor s určitým pěstitelským propojením na

hostitelské rostliny označené za zamořené podle 5 odst. 1 písm. a),

včetně těch, které mají společné pěstitelské zařízení a vybavení a ve

kterých byly společně používány zemědělské stroje, a to přímo nebo

prostřednictvím společného smluvního partnera,



- hostitelské rostliny pěstované v místě(-ech) produkce uvedeném(-ých)

v předcházející odrážce nebo nacházející se v takovém(-ých) místě(-ech)

během období, kdy se hostitelské rostliny označené za zamořené podle §

5 odst. 1 písm. a) nacházely v takových prostorách nebo místech

produkce uvedených v první odrážce,



- společné sklady skladující hostitelské rostliny z výše uvedených míst

produkce,



- zařízení, stroje, dopravní prostředek, sklad nebo jeho části a

veškeré jiné předměty včetně obalového materiálu, které mohly přijít do

styku s hostitelskými rostlinami označenými za zamořené podle § 5 odst.

1 písm. a) během předcházejících 12 měsíců nebo kratšího období, pokud

je to odborně odůvodněno,



- hostitelské rostliny, které se skladují nebo jsou v kontaktu se

stavbami nebo předměty vyjmenovanými v předcházející odrážce, a to do

provedení očisty a dezinfekce těchto staveb nebo objektů způsobem

stanoveným v příloze č. 6,



– hostitelské rostliny, které mají na základě testování podle § 6

stejný klonový původ jako hostitelské rostliny označené za zamořené

podle § 5 odst. 1 písm. a), a u kterých rostlinolékařská správa na

základě odborného šetření podle § 76 odst. 2 zákona označí vzhledem ke

klonové souvislosti zamoření za pravděpodobné, a to včetně rostlin

testovaných s negativním výsledkem; v případě pochybností o identitě

zamořených a klonově příbuzných hostitelských rostlin rostlinolékařská

správa určí testování odrůdové pravosti,



- místo produkce, ve kterém byly hostitelské rostliny uvedené v

předchozí odrážce pěstovány nebo skladovány,



- místo produkce, ve kterém se používala povrchová voda k postřiku nebo

k zavlažování původem ze zdroje, označeného podle § 5 odst. 2 písm. b)

za zamořený původcem hnědé hniloby,



- hostitelské rostliny původce hnědé hniloby vypěstované na pozemcích

zaplavených vodou, označenou podle § 5 odst. 2 písm. b) za zamořenou

původcem hnědé hniloby.



3. Při stanovení rozsahu možného rozšíření původce kroužkovitosti nebo

původce hnědé hniloby podle § 5 odst. 1 písm. c) je nutno posoudit

zejména:



- blízkost ostatních míst produkce, kde se pěstují brambory či jiné

hostitelské rostliny,



- místa výsadby anebo užívání společně skladovaných sadbových brambor,



- místo produkce, na němž jsou hostitelské rostliny zavlažovány nebo

postřikovány povrchovou vodou, pokud existuje nebo existovalo

nebezpečí, že tato voda zaplavila místo produkce označené podle § 5

odst. 1 písm. a) za zamořené původcem hnědé hniloby,



- místo produkce, na němž jsou hostitelské rostliny pěstovány

bezprostředně vedle povrchové vody označené podle § 5 odst. 2 písm. b)

za zamořenou původcem hnědé hniloby, nebo které mohou být touto

povrchovou vodou zaplaveny,



- každou jednotlivou zavlažovací nádrž, která je spojena s povrchovou

vodou označenou podle § 5 odst. 2 písm. b) za zamořenou původcem hnědé

hniloby,



– vodní objekty, které jsou spojeny s povrchovou vodou označenou podle

§ 5 odst. 2 písm. b) za zamořenou původcem hnědé hniloby, s

přihlédnutím ke směru toku a množství průtoku této vody a k planě

rostoucím hostitelským rostlinám původce hnědé hniloby z čeledi

lilkovitých.



4. Náležitosti oznámení potvrzeného výskytu původce kroužkovitosti nebo

původce hnědé hniloby podle § 5 odst. 3.



4.1. Bezprostředně po potvrzení přítomnosti původce kroužkovitosti nebo

hnědé hniloby laboratorními testy za použití metod stanovených v

příloze č. 1 se oznámí Komisi a členským státům alespoň:



- u bramboru název odrůdy příslušné partie, druh dodávky (konzumní,

sadba atd.), u sadby kategorie rozmnožovacího materiálu,



- u rajčete název odrůdy příslušné partie a případně kategorie

rozmnožovacího materiálu.



Aniž jsou dotčeny požadavky na oznámení podezření z výskytu původce

kroužkovitosti nebo hnědé hniloby podle § 4 odst. 4, pokud je potvrzen

výskyt v partii bramboru nebo rajčete původem z jiného členského

státu(jiných členských států) nebo hrozí riziko zamoření bramboru nebo

rajčete v jiném členském státu(jiných členských státech), musí být

neprodleně oznámeny dotčenému státu(dotčeným státům) informace nezbytné

ke splnění opatření dle § 5 odst. 4, zejména:



- název odrůdy příslušné partie bramboru nebo rajčete,



- název a adresa odesílatele a příjemce partie,



- datum doručení a množství doručené partie,



- identifikace příslušného rostlinolékařského osvědčení podle § 21

odst. 1 písm. d) zákona, popřípadě kopie nebo číslo rostlinolékařského

pasu, nebo registrační číslo pěstitele nebo obchodníka a kopie dodacího

listu.



4.2. Po ukončení všech šetření se oznámí:



- datum potvrzení zamoření,



- stručný popis šetření provedeného k zjištění zdroje a možného

rozšíření zamoření, včetně rozsahu provedeného odběru vzorků,



- informace o zjištěném nebo předpokládaném zdroji(zdrojích) zamoření,



- podrobnosti o rozsahu zamoření, včetně počtu míst produkce a počtu

partií s uvedením odrůdy a u sadbových brambor kategorie rozmnožovacího

materiálu,



- podrobnosti o vymezeném karanténním území a bezpečnostní zóně, včetně

počtu míst produkce, která nebyla označena jako zamořená, ale nacházejí

se v karanténním území nebo v bezpečnostní zóně,



- v případě původce hnědé hniloby podrobnosti o určení vodního zdroje,

včetně názvu a umístění vodního objektu a rozsahu označení oblasti se

zákazem zavlažování;



- pro každou zásilku nebo partii rostlin rajčete označenou za

zamořenou, příslušné rostlinolékařské osvědčení podle § 21 odst. 1

písm. d) zákona a číslo rostlinolékařského pasu;



- další informace související s potvrzeným(i) zdrojem(zdroji) zamoření,

které si Komise případně vyžádá.



Příloha 4



Opatření po potvrzení přítomnosti původce kroužkovitosti nebo původce

hnědé hniloby



1.



Způsob naložení s partií hostitelské rostliny označenou za zamořenou



S partií hostitelské rostliny, označenou za zamořenou podle § 5 odst. 1

písm. a), musí být naloženo na základě nařízení rostlinolékařské správy

podle § 7 odst. 1 písm. a) některým z níže uvedených způsobů:



a) odvoz do řízené skládky a okamžité převrstvení vhodným materiálem

(zemina, suť apod.) tak, aby nemohlo dojít ke zcizení hlíz a k dalšímu

šíření původce kroužkovitosti ani původce hnědé hniloby; mohou být

přitom využity jen takové skládky, u nichž je vyloučeno nebezpečí

průsaku na zemědělsky využívanou ornou půdu nebo v případě hlíz

napadených původcem hnědé hniloby do povrchových vod využívaných k

zavlažování zemědělské půdy;



b) v případě hlíz bramboru tepelné zpracování v pařících zařízeních,

při němž jsou hlízy vystaveny teplotě nejméně 75 st. C po dobu nejméně

deseti minut, a následné zkrmení hospodářskými zvířaty;



c) v případě hlíz bramboru prostřednictvím přímé a okamžité dodávky

partie do zpracovatelského podniku tepelné zpracování hlíz pro

průmyslové nebo potravinářské účely, při němž jsou hlízy vystaveny

teplotě nejméně 75 st. C po dobu nejméně deseti minut nebo, v případě

naložení s partií na území České republiky, zpracovány takovým

technologickým postupem, schváleným rostlinolékařskou správou, který

vylučuje další šíření původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby;

přesun zamořených partií povolí rostlinolékařská správa jen do podniků

touto správou písemně k tomu účelu schválených, a to na základě

ověření, že v podniku funguje systém očisty a dezinfekce skladovacích

prostor a odvozových vozidel a že podnik splňuje požadavky na

zneškodňování nebo likvidaci odpadů, stanovené v příloze č. 5,



d) v případě původce kroužkovitosti zpracování hlíz silážováním se

silážní kukuřicí za podmínky rozřezání hlíz a jejich rovnoměrného

rozvrstvení do celého objemu silážované kukuřice; rostlinolékařská

správa posoudí konkrétní podmínky silážování před použitím tohoto

opatření a stanoví konkrétní postupy, které vyloučí možnost šíření

původce kroužkovitosti,



e) jiné opatření, které bylo předem písemně schváleno rostlinolékařskou

správou, pokud bylo prokázáno, že neexistuje rozpoznatelné riziko

rozšíření původce kroužkovitosti ani hnědé hniloby, takové opatření

musí být rostlinolékařskou správou nařízeno určité povinné osobě včetně

stanovení podmínek pro bezrizikové naložení s odpady,



f) spálení s přihlédnutím ke zvláštnímu zákonu^1).



Při likvidaci jakéhokoliv odpadu souvisejícího s výše uvedenými

možnostmi nebo vzniklého z výše uvedených možností musí být splněny

požadavky na zneškodňování odpadů stanovené v příloze č. 5.



Opatření pod písmenem a) je možné použít k naložení s partií označenou

jako zamořená jen v případě, kdy nebylo možné zcela využít postup v

písmenech b) až e). Opatření nařízená v souladu s písmeny d) a e)

sděluje rostlinolékařská správa neprodleně Komisi a ostatním členským

státům. Pokud má být opatření pod písmeny a) až e) provedeno na území

jiného členského státu, povinnná osoba o tom informuje

rostlinolékařskou správu, která tuto informaci sdělí úřední organizaci

rostlinolékařské péče příslušného členského státu.



2.



Způsob naložení s partií hostitelské rostliny označenou za

pravděpodobně zamořenou



S partií hostitelské rostliny, označenou za pravděpodobně zamořenou

podle § 5 odst. 1 písm. b), musí být naloženo na základě nařízení

rostlinolékařské správy podle § 7 odst. 1 písm. b) některým z níže

uvedených způsobů:



a) konzumace hlíz bramboru balením upravených pro přímé dodání do místa

spotřeby a použití bez přebalování jako konzumní brambory, v místě s

vhodným zařízením na likvidaci odpadu dle požadavků stanovených v

příloze č. 5; přesun partií podezřelých ze zamoření původcem hnědé

hniloby povolí rostlinolékařská správa jen do míst touto správou

písemně k tomu účelu schválených, a to na základě ověření, že v podniku

funguje systém dezinfekce skladovacích prostor a odvozových vozidel a

že podnik splňuje požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v

příloze č. 5,



b) v případě hlíz bramboru tepelné zpracování v pařících zařízeních,

při němž jsou hlízy vystaveny teplotě nejméně 75 st. C po dobu nejméně

deseti minut, a následné zkrmení hospodářskými zvířaty;



c) v případě hlíz bramboru prostřednictvím přímé a okamžité dodávky

partie do zpracovatelského podniku tepelné zpracování hlíz pro

průmyslové nebo potravinářské účely, při němž jsou hlízy vystaveny

teplotě nejméně 75 st. C po dobu nejméně deseti minut nebo, v případě

naložení s partií na území České republiky, zpracovány takovým

technologickým postupem, schváleným rostlinolékařskou správou, který

vylučuje další šíření původce kroužkovitosti a původce hnědé hniloby;

přesun partií podezřelých ze zamoření povolí rostlinolékařská správa

jen do podniků touto správou písemně k tomu účelu na území České

republiky schválených, a to na základě ověření, že v podniku funguje

systém dezinfekce skladovacích prostor a odvozových vozidel a že podnik

splňuje požadavky na zneškodňování odpadů, stanovené v příloze č. 5,



d) v případě původce kroužkovitosti zpracování hlíz silážováním se

silážní kukuřicí za podmínky rozřezání hlíz a jejich rovnoměrného

rozvrstvení do celého objemu silážované kukuřice; rostlinolékařská

správa posoudí konkrétní podmínky silážování před použitím tohoto

opatření a stanoví konkrétní postupy, které vyloučí možnost šíření

původce kroužkovitosti,



e) v případě původce kroužkovitosti a rozmnožovacího materiálu bramboru

výsadba hlíz v karanténním území vymezeném podle § 5 odst. 1 písm. c)

za podmínek, že:



– hlízy byly v tomto karanténním území vypěstovány a bylo prokázáno, že

nedošlo k jejich bezprostřednímu kontaktu s hlízami partie označené za

zamořenou,



– se karanténní území nenachází v uzavřené pěstební oblasti pro výrobu

rozmnožovacího materiálu bramboru podle zvláštního zákona^2),



– porost bude rostlinolékařskou správou kontrolován a testován dle

přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti,



– hlízy sklizené z příslušného porostu budou použity pouze způsobem

podle písmene b) popř. d), pokud nepůjde o hlízy z partie označené za

zamořenou,



f) jiné opatření, které bylo předem písemně schváleno rostlinolékařskou

správou a při kterém neexistuje rozpoznatelné riziko rozšíření původce

kroužkovitosti ani původce hnědé hniloby, takové opatření musí být

rostlinolékařskou správou nařízeno určité povinné osobě včetně

stanovení podmínek pro bezrizikové naložení s odpady.



Při likvidaci jakéhokoliv odpadu souvisejícího s výše uvedenými

možnostmi nebo vzniklého z výše uvedených možností musí být splněny

požadavky na zneškodňování odpadů stanovené v příloze č. 5.



Opatření nařízená v souladu s písmeny d), e) a f) sděluje

rostlinolékařská správa neprodleně Komisi a ostatním členským státům.

Pokud má být opatření pod písmeny a) až d) provedeno na území jiného

členského státu, povinná osoba o tom v předstihu informuje

rostlinolékařskou správu, která tuto informaci sdělí úřední organizaci

rostlinolékařské péče příslušného členského státu tak, aby bylo možno

zajistit úřední kontrolu nad plněním nařízeného opatření.



3.



Ošetření celých rostlin a posklizňových zbytků rostlin Všechny rostliny

partie podezřelé ze zamoření nebo zamořené se odstraní z pozemku nebo

objektu a uloží do řízené skládky odpadů v souladu se zněním v bodě 1.

písm. a) nebo spálí způsobem, kterým nedojde k porušení zákonných

ustanovení o ochraně ovzduší. Tento způsob se doporučuje zejména pro

rostliny rajčete.



Pěstované rostliny partie podezřelé ze zamoření nebo zamořené je možno

v případě původce kroužkovitosti namísto opatření uvedených v bodech 1.

a 2. nebo spálení likvidovat totálním herbicidem do doby, kdy lze

zaručit i likvidaci podzemních částí rostlin, a následně porost zaorat.



Opatření nařízená podle tohoto bodu sděluje rostlinolékařská správa

neprodleně Komisi a ostatním členským státům.



4.



Opatření v karanténním území po potvrzení výskytu původce

kroužkovitosti



4.1. V karanténním území, které zahrnuje místo produkce označené za

zamořené původcem kroužkovitosti podle § 5 odst. 1 písm. a),

rostlinolékařská správa po potvrzení výskytu původce kroužkovitosti

nařídí podle § 7 odst. 1 písm. d), že uživatel pozemků v tomto území:



4.1.1. na pozemku označeném za zamořený původcem kroužkovitostií podle

§ 5 odst. 1 písm. a):



a) nesmí po dobu tří vegetačních období následujících po roce potvrzení

výskytu původce kroužkovitosti pěstovat brambor včetně osiva, a musí

systematicky vyhledávat a likvidovat planě rostoucí rostliny bramboru a

ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce kroužkovitosti (§

76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona)



nebo



musí tento pozemek po čtyři vegetační období udržovat jako černý úhor

nebo jej po prvním roce černého úhoru na dobu tří vegetačních období

zatravnit nebo osít jetelem, jetelotrávou, vojtěškou nebo

vojtěškotrávou a porost na něm udržovat sekáním jako co nejnižší

strniště, či intenzivně spásat, a musí na něm vyhledávat a odstraňovat

planě rostoucí rostliny bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské

rostliny původce kroužkovitosti (§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona);



b) smí pěstovat brambor v prvém roce, který následuje po splnění

ustanovení uvedených pod písm. a), ale jen s podmínkou, že



- během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti

uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl

shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru a ostatních planě

rostoucích hostitelských rostlin původce kroužkovitosti,



- k výsadbě bude použit rozmnožovací materiál3) nebo farmářská sadba4)

vypěstovaná pod kontrolou rostlinolékařské správy a testovaná dle

přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním, a



- sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému

zpracování (§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona)



c) po splnění ostatních mimořádných rostlinolékařských opatření

nařízených v karanténním území podle bodu 4 smí v dalším sklizňovém

období následujícím po příslušném rotačním cyklu, který musí činit

nejméně 2 roky, pěstovat brambory na sadbu nebo na konzum s podmínkou,

že rostlinolékařská správa provede vymezovací průzkum výskytu původce

kroužkovitosti podle § 3 odst. 3, k výsadbě bude použit rozmnožovací

materiál^3) nebo farmářská sadba^4) vypěstovaná pod kontrolou

rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce

kroužkovitosti s výsledkem negativním, a sklizené hlízy budou testovány

dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti.



4.1.2. na pozemku jiném než označeném za zamořený původcem

kroužkovitosti podle § 5 odst. 1 písm. a), na kterém byl v roce

potvrzení výskytu původce kroužkovitosti pěstován brambor, nesmí po

dobu dvou následujících vegetačních období pěstovat brambor; /§ 76

odst.1 písm. a) bod 1. zákona/;



4.1.3. na pozemku jiném než označeném za zamořený původcem

kroužkovitosti podle § 5 odst. 1 písm. a), na kterém nebyl v roce

potvrzení výskytu původce kroužkovitosti pěstován brambor, smí ve

vegetačním období, které následuje po roce potvrzení výskytu původce

kroužkovitosti, pěstovat brambor, ale jen s podmínkou, že



- rostlinolékařská správa protokolárně neshledá žádné riziko šíření

původce kroužkovitosti planě rostoucími rostlinami bramboru ani jinými

planě rostoucími hostitelskými rostlinami původce kroužkovitosti, a



- sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému

zpracování



/§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona/;



4.1.4. musí po dobu čtyř úplných vegetačních období od potvrzení

výskytu původce kroužkovitosti vyhledávat a likvidovat planě rostoucí

rostliny bramboru a jiné planě rostoucí hostitelské rostliny původce

kroužkovitosti /§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona/ a sklizené brambory

musí být testovány postupem podle přílohy č. 1 [§ 76 odst. 1 písm. d)

zákona];



4.1.5. musí zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování

rozmnožovacího materiálu^3)bramboru a farmářské sadby^4) vypěstované

pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle prílohy č. 1 na

výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním od ostatních

rostlin bramboru /§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona /;



4.1.6. musí způsobem uvedeným v příloze č. 6:



- jednorázově provést očistu a dezinfekci objektů a předmětů, které

přišly do kontaktu se zamořenou partií anebo s partií pravděpodobně

zamořenou, a to nejpozději do té doby, než přijdou do styku s jinými

partiemi hostitelských rostlin /§ 76 odst.1 písm. c)) zákona/;



– provádět očistu strojů, dopravních prostředků, skladovacích prostor,

třídicích linek, obalů, palet a jiných předmětů po každém použití při

výrobě hlíz bramboru po dobu stanovenou rostlinolékařskou správou [§ 76

odst. 1 písm. a) bod 2. zákona]; očista strojů se provádí po ukončení

jejich práce na jednom pozemku s alespoň jedním porostem bramboru,

očista skladovacích prostorů, obalů, palet, třídiček, dopravních

prostředků a jiných předmětů vždy po vyskladnění jedné partie nebo

ukončení práce s jednou partií;



- provádět po dobu tří úplných vegetačních období od potvrzení výskytu

původce kroužkovitosti závěrečnou očistu sklizňové techniky po ukončení

sklizně a závěrečnou očistu a dezinfekci všech strojů, dopravních

prostředků, třídících linek, obalů, palet a jiných předmětů použitých

při posklizňové úpravě, naskladnění a vyskladnění, která musí být

ukončena před novým použitím /§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona/;



4.1.7. smí k pěstování bramboru po dobu tří let následujících po roce

potvrzení výskytu původce kroužkovitosti používat jen rozmnožovací

materiál^3) nebo farmářská sadba^4) vypěstovaná pod kontrolou

rostlinolékařské správy a testovaná dle přílohy č. 1 na výskyt původce

kroužkovitosti s výsledkem negativním, /§ 76 odst.1 písm. a)bod 1.

zákona/;



4.1.8. nesmí vysazovat krájené hlízy bramboru nebo vysazovat hlízy

bramboru pomocí napichovacích sazečů /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1.

zákona/;



4.1.9. nesmí množit rozmnožovací materiál^1) bramboru ani pro vlastní

potřebu ve vegetačním období bezprostředně následujícím po vegetačním

období, v němž nebo z jehož sklizně byl výskyt původce kroužkovitosti

zjištěn /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona/;



4.1.10. smí přemisťovat mimo toto území pouze partie bramboru, které

byly úředním laboratorním testováním shledány prostými původce

kroužkovitosti a partie označené rostlinolékařskou správou jako

zamořené nebo pravděpodobně zamořené při splnění všech podmínek v

nařízeném opatření /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona/.



Sklizené hlízy bramboru balením upravené pro přímé dodání do místa

spotřeby na území České republiky a určené k použití bez přebalování

jako konzumní brambory lze přemisťovat mimo karanténní území ihned po

odběru úředního vzorku, pokud byla příslušná partie prohlédnuta v době

sklizně rostlinolékařskou správou na výskyt příznaků původce

kroužkovitosti, včetně prohlídky řezu dužniny hlíz, s negativním

výsledkem.



4.1.11. smí vyvážet rostliny bramboru vypěstované v tomto území do

třetích zemí pouze pokud budou dodrženy úřední dovozní karanténní

podmínky, stanovené orgánem rostlinolékařské péče dovážející země /§ 76

odst. 1 písm. a)bod 1. zákona/;



4.1.12. nesmí používat zemědělské nářadí a mechanizační prostředky,

používané při pěstování, sklizni, posklizňové úpravě, přepravě a

skladování brambor, které přišly do kontaktu se zamořenými partiemi, po

dobu jednoho roku od doby potvrzení výskytu původce kroužkovitosti mimo

toto území bez řádné očisty a dezinfekce provedené způsobem uvedeným v

příloze č. 6 /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona/;



4.2. Při potvrzení původce kroužkovitosti v produkčních systémech, kde

je možná úplná výměna pěstebního substrátu (např. ve sklenících

šlechtitelů či při pěstování minihlízek, meristémů a pod.) uživatel

pozemků:



a) nesmí pěstovat brambor, včetně osiva, pokud nedojde pod kontrolou

rostlinolékařské správy k eradikaci původce kroužkovitosti, včetně

odstranění všech rostlin bramboru nebo jiných rostlin čeledi

Solanaceae, úplné výměně pěstebního substrátu a vyčištění a dezinfekci

veškerých objektů, strojů a zařízení provedené způsobem uvedeným v

příloze č. 6 /§ 76 odst.1 písm. a) zákona/;



b) musí další pěstování bramboru založit z rozmnožovacího materiálu

odvozeného z rostlin testovaných na výskyt původce kroužkovitosti s

negativním výsledkem /§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona/.



4.3. Zjištění planě rostoucích rostlin bramboru v karanténním území

podle bodu 4.1.4. musí uživatel pozemků v tomto území ohlásit

rostlinolékařské správě a před likvidací těchto rostlin musí umožnit

jejich úřední testování na přítomnost původce kroužkovitosti. Při

potvrzení výskytu původce kroužkovitosti při tomto testování se

příslušný pozemek považuje za pozemek zamořený /§ 76 odst.1 písm. a)

bod 2. zákona/.



4.4. Rostlinolékařská správa provádí namátkově dohled nad pozemky a

objekty, ve kterých se pěstují či skladují rostliny bramboru nebo se s

těmito rostlinami nakládá, zejména nad prováděním očisty a dezinfekce

mechanizace, která je využívána v porostech bramboru a ve sklizených

hlízách bramboru také v jiných místech produkce.



4.5. V bezpečnostní zóně, vymezené v místě produkce na základě

pravděpodobného zamoření a nebo možného rozšíření původce

kroužkovitosti podle § 5 odst. 1 písm. c), rostlinolékařská správa

nařídí podle § 7 odst. 1 písm. d), že uživatel pozemků v tomto území

musí po dobu tří úplných vegetačních období od potvrzení výskytu

původce kroužkovitosti:



a) provádět závěrečnou očistu sklizňové techniky po ukončení sklizně a

závěrečnou očistu a dezinfekci všech strojů, dopravních prostředků,

třídících linek, obalů, palet a jiných předmětů použitých při

posklizňové úpravě, naskladnění a vyskladnění, která musí být ukončena

před zahájením nové pěstitelské sezóny /§ 76 odst.1 písm. a) bod 2.

zákona/;



b) musí zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování

rozmnožovacího materiálu bramboru^3) a farmářské sadby^4) vypěstované

pod kontrolou rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na

výskyt původce kroužkovitosti s výsledkem negativním od ostatních

rostlin bramboru [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];



c) musí k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál3) nebo

farmářskou sadbu^4) vypěstovanou pod kontrolou rostlinolékařské správy

a testovanou dle přílohy č. 1 na výskyt původce kroužkovitosti s

výsledkem negativním /§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona/.



5.



Opatření v karanténním území po potvrzení výskytu původce hnědé hniloby



5.1. V karanténním území, které zahrnuje místo produkce označené za

zamořené původcem hnědé hniloby podle § 5 odst. 1 písm. a) nebo

povrchovou vodu označenou za zamořenou podle § 5 odst. 2 písm. b),

rostlinolékařská správa po potvrzení výskytu původce hnědé hniloby

nařídí podle § 7 odst. 1 písm. d), že uživatel pozemků v tomto území:



5.2.1. na pozemku označeném za zamořený původcem hnědé hniloby podle §

5 odst. 1 písm. a):



a) nesmí po dobu čtyř vegetačních období pěstovat hostitelské rostliny

původce hnědé hniloby včetně osiva bramboru a rajčete, a jiné rostliny

prokazatelně umožňující jeho přenos, tj. rostliny, u nichž se sklízejí

části, které jsou v bezprostředním kontaktu s půdou a na kterých po

sklizni ulpívá zemina (např. rostliny určené k pěstování s kořeny,

některé druhy rodu Brassica, bulevnaté, cibulové a hlíznaté květiny) /§

76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona/, a musí vyhledávat a likvidovat

planě rostoucí hostitelské rostliny včetně plevelů /§ 76 odst. 1 písm.

a)bod 2. zákona/ nebo



b) musí tento pozemek po první tři vegetační období udržovat jako černý

úhor nebo na nich pěstovat obiloviny, často sekané či intenzívně

spásané trvalé pícniny či trávy na semeno /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2.

zákona/ a v dalších dvou letech na něm smí pěstovat jen nehostitelské

rostliny, které neumožňují přežití či přenos původce hnědé hniloby, a

musí se na něm v průběhu těchto pěti let vyhledávat a likvidovat planě

rostoucí hostitelské rostliny včetně plevelů /§ 76 odst. 1 písm. a)

zákona/;



c) smí v případě režimu podle písmene a) pěstovat brambor nebo rajče v

prvním vegetačním období, které následuje po splnění ustanovení

uvedených pod písmenem a), ale jen s podmínkou, že



– během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti

uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl

shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru, rajčete a jiných

hostitelských rostlin, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a



– v případě pěstování brambor bude k výsadbě použit rozmnožovací

materiál^3), a



– sklizeň bude určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému

zpracování,



– v případě bramboru a rajčete budou sklizené bramborové hlízy či

rostliny rajčete testovány postupem podle přílohy č. 1;



následně smí pěstovat brambor nebo rajče až po uplynutí vhodné rotace

plodin stanovené rostlinolékařskou správou a v případě pěstování

brambor musí k výsadbě použit rozmnožovací materiál^3), a sklizeň musí

být určena pouze ke konzumním účelům nebo k průmyslovému zpracování,

pro případné pěstování sadbových brambor musí být předem proveden

vymezovací průzkum výskytu původce hnědé hniloby podle § 3 odst. 3 [§

76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];



d) smí v případě režimu podle písmene b) pěstovat brambor nebo rajče v

prvním vegetačním období, které následuje po splnění ustanovení

uvedených pod písmenem b), ale jen s podmínkou, že



– během předcházejících dvou let bylo na základě písemné žádosti

uživatele pozemku rostlinolékařskou správou ověřeno, že pozemek byl

shledán prostým planě rostoucích rostlin bramboru, rajčete a jiných

hostitelských rostlin původce hnědé hniloby, včetně plevelů z čeledi

lilkovitých, a



– v případě pěstování brambor bude k výsadbě použit rozmnožovací

materiál3), a



– brambory mohou být pěstovány pro sadbové nebo konzumní účely nebo k

průmyslovému zpracování, a v případě bramboru a rajčete budou sklizené

bramborové hlízy, případně rostliny rajčete, testovány postupem podle

přílohy č. 1 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];



e) smí po splnění ostatních mimořádných rostlinolékařských opatření

nařízených v karanténním území podle bodu 5 poprvé na tomto pozemku

pěstovat brambor nebo jinou hostitelskou rostlinu původce hnědé

hniloby, pouze použije-li rozmnožovací materiál^3), který byl úředně

uznán podle zvláštního zákona^5), a musí o zamýšleném prvním pěstování

hostitelských rostlin na tomto pozemku informovat písemně

rostlinolékařskou správu v takovém předstihu, aby bylo možno provést

vymezovací průzkum výskytu původce hnědé hniloby podle § 3 odst. 3.



f) nesmí být prováděna umělá závlaha po dobu pěti vegetačních období

následujících po roce potvrzení výskytu původce hnědé hniloby /§ 76

odst. 1 písm. a) bod 2. zákona/.



5.2.2. na pozemku jiném než označeném za zamořený původcem hnědé

hniloby podle § 5 odst. 1 písm. a):



a) nesmí ve vegetačním období následujícím po vegetačním období, v němž

nebo z jehož sklizně byl zjištěn výskyt původce hnědé hniloby, včetně

osiva bramboru a rajčete, pěstovat brambor nebo jiné hostitelské

rostliny původce hnědé hniloby a musí cíleně vyhledávat a likvidovat

planě rostoucí rostliny rajčete, bramboru a jiných hostitelských

rostlin, včetně hostitelských druhů plevelů /§ 76 odst.1 písm. a) bod

2. zákona/, nebo



– smí pěstovat brambor za podmínky, že k výsadbě bude použit pouze

rozmnožovací materiál3), který byl úředně uznán podle zvláštního

zákona5), a produkce bude určena výlučně pro konzumní účely nebo k

průmyslovému zpracování [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona],



– smí pěstovat rajče pouze z osiva, které odpovídá požadavkům podle

zvláštního právního předpisu6), a to pouze pro produkci plodů [§ 76

odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];



b) smí po dobu dvou let následujících po roce provedení opatření podle

písmene a)



– k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál3) nebo

farmářskou sadbu^4) vypěstovanou pod kontrolou rostlinolékařské správy

a testovanou dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s

výsledkem negativním,



– k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům

podle zvláštního právního předpisu^6), nebo rostliny rajčete

vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§

76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];



c) musí ihned po označení místa produkce za zamořené a následně až do

doby prvého přípustného pěstování bramboru nebo rajčete každoročně

provádět očistu a dezinfekci všech strojů a skladovacích zařízení

používaných při pěstování bramboru nebo rajčete způsobem uvedeným v

příloze č. 6 [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];



d) smí provádět závlahu jen se souhlasem a pod dohledem

rostlinolékařské správy za předpokladu, že je vyloučeno jakékoliv

zjistitelné nebezpečí šíření původce hnědé hniloby /§ 76 odst. 1 písm.

a) bod 2. zákona/,



e) musí po dobu tří úplných vegetačních období od potvrzení výskytu

původce hnědé hniloby vyhledávat a likvidovat planě rostoucí rostliny

bramboru a ostatní planě rostoucí hostitelské rostliny původce hnědé

hniloby [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona].



5.3. nesmí vysazovat krájené hlízy bramboru nebo vysazovat hlízy

bramboru pomocí napichovacích sazečů /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1.

zákona/;



5.4. smí přemisťovat mimo toto území pouze partie bramboru, které byly

úředním laboratorním testováním shledány prostými původce hnědé hniloby

a partie označené rostlinolékařskou správou jako zamořené nebo

pravděpodobně zamořené při splnění všech podmínek v nařízeném opatření

/§ 76 odst.1 písm. a) bod 1. zákona/. Sklizené hlízy bramboru balením

upravené pro přímé dodání do místa spotřeby na území České republiky a

určené k použití bez přebalování jako konzumní brambory lze přemisťovat

mimo karanténní území ihned po odběru úředního vzorku, pokud byla

příslušná partie prohlédnuta v době sklizně rostlinolékařskou správou

na výskyt příznaků původce hnědé hniloby, včetně prohlídky řezu dužniny

hlíz, s negativním výsledkem.



5.5. smí vyvážet rostliny bramboru vypěstované v tomto území do třetích

zemí pouze pokud budou dodrženy úřední dovozní karanténní podmínky,

stanovené orgánem rostlinolékařské péče dovážející země /§ 76 odst. 1

písm. a) bod 1. zákona/;



5.6. nesmí používat zemědělské nářadí a mechanizační prostředky,

používané při pěstování, sklizni, posklizňové úpravě, přepravě a

skladování brambor, které přišly do kontaktu se zamořenými partiemi, po

dobu jednoho roku od doby potvrzení výskytu původce hnědé hniloby mimo

toto území bez řádné očisty a dezinfekce provedené způsobem uvedeným v

příloze č. 6 /§ 76 odst.1 písm. a) bod 2. zákona/;



5.7. Při potvrzení původce hnědé hniloby v produkčních systémech, kde

je možná úplná výměna pěstebního substrátu (např. ve sklenících

šlechtitelů či při pěstování minihlízek, meristémů a pod.) uživatel

pozemků:



a) nesmí pěstovat brambor nebo jiné hostitelské rostliny původce hnědé

hniloby včetně osiva bramboru a rajčete, pokud nedojde pod kontrolou

rostlinolékařské správy k eradikaci původce hnědé hniloby, včetně

odstranění všech rostlin bramboru a rajčete, úplné výměně pěstebního

substrátu a vyčištění a dezinfekce veškerých objektů, strojů a zařízení

provedené způsobem uvedeným v příloze č. 6 /§ 76 odst. 1 písm. a)/;



b) musí další pěstování bramboru založit po souhlasu rostlinolékařské

správy z rozmnožovacího materiálu3) úředně uznaného podle zvláštního

zákona5) nebo získaného z rostlin testovaných na výskyt původce hnědé

hniloby s negativním výsledkem /§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona/;



c) musí k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá

požadavkům podle zvláštního právního předpisu6), nebo rostliny rajčete

vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§

76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona];



d) smí uměle zavlažovat porosty bramboru nebo rajčete jen se souhlasem

rostlinolékařské správy a umožní rostlinolékařské správě provádět

úřední kontrolu zavlažovacích systémů v karanténním území /§ 76 odst.1

písm. a) bod 2. zákona/.



5.8. Zjištění planě rostoucích rostlin bramboru nebo rajčete v

karanténním území podle bodu 5.2.2. písm. a) musí uživatel pozemků v

tomto území ohlásit rostlinolékařské správě a před likvidací těchto

rostlin musí umožnit jejich úřední testování na přítomnost původce

hnědé hniloby. Při potvrzení výskytu původce hnědé hniloby při tomto

testování se příslušný pozemek považuje za pozemek zamořený /§ 76

odst.1 písm. a) bod 2. zákona/.



5.9. Rostlinolékařská správa provádí namátkově dohled nad pozemky a

objekty, ve kterých se pěstují či skladují rostliny bramboru a rajčete

nebo se s těmito rostlinami nakládá, zejména nad prováděním očisty a

dezinfekce mechanizace, která je využívána v porostech bramboru a

rajčete a ve sklizených hlízách bramboru také v jiných místech

produkce.



5.10. V bezpečnostní zóně, vymezené v místě produkce na základě

pravděpodobného zamoření a nebo možného rozšíření původce hnědé hniloby

podle § 5 odst. 1 písm. c), rostlinolékařská správa nařídí podle § 7

odst. 1 písm. d), že uživatel pozemků v tomto území musí po dobu tří

úplných vegetačních období od potvrzení výskytu původce hnědé hniloby:



a) provádět závěrečnou očistu sklizňové techniky po ukončení sklizně a

závěrečnou očistu a dezinfekci všech strojů, dopravních prostředků,

třídících linek, obalů, palet a jiných předmětů použitých při

posklizňové úpravě, naskladnění a vyskladnění, která musí být ukončena

před zahájením nové pěstitelské sezóny /§ 76 odst.1 písm. a) bod 2.

zákona/;



b) zabezpečit oddělenou manipulaci a oddělené skladování rozmnožovacího

materiálu^3) bramboru a farmářské sadby4) vypěstované pod kontrolou

rostlinolékařské správy a testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce

hnědé hniloby s výsledkem negativním od ostatních rostlin bramboru [§

76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];



c) k pěstování bramboru používat jen rozmnožovací materiál3) nebo

farmářskou sadbu^4) vypěstované pod kontrolou rostlinolékařské správy a

testované dle přílohy č. 1 na výskyt původce hnědé hniloby s výsledkem

negativním [§ 76 odst. 1 písm. a) bod 1. zákona];



d) k pěstování rajčete používat pouze osivo, které odpovídá požadavkům

podle zvláštního právního předpisu^6), nebo rostliny rajčete

vypěstované z uvedeného osiva pod kontrolou rostlinolékařské správy [§

76 odst. 1 písm. a) bod 2. zákona].



5.11. V karanténním území, vymezeném podle § 5 odst. 2 písm. c) na

základě označení povrchové vody za zamořenou původcem hnědé hniloby

nebo v bezpečnostní zóně vymezené podle § 5 odst. 2 písm. c)

rostlinolékařská správa:



a) provádí každoročně průzkum výskytu původce hnědé hniloby, a to

vzorkováním povrchové vody a případných hostitelských rostlin z čeledi

lilkovitých u dotyčných zdrojů vody způsobem stanoveným

rostlinolékařskou správou a následným testováním podle příslušných

metod stanovených v příloze č. 1;



b) provádí kontrolu zavlažovacích a postřikových systémů a popřípadě

stanoví takové podmínky umělého zavlažování hostitelských rostlin

původce hnědé hniloby, aby se zabránilo jeho šíření, včetně zákazu

používání vody označené za zamořenou k zavlažování a postřiku

hostitelských rostlin původce hnědé hniloby. Tento zákaz může být

odvolán v případě, kdy je na základě výsledků prováděného průzkumu

prokázáno, že povrchová voda již není zamořena, nebo že jsou používány

k zavlažování a postřiku technologie schválené rostlinolékařskou

správou, které vylučují výskyt původce hnědé hniloby a jeho šíření;



c) v případě zamoření odpadních vod provádí kontrolu zneškodňování

zamořených odpadních vod z průmyslových zpracovatelských a balicích

závodů, které manipulují s bramborami.



-----------------



1) Zákon č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších

zákonů (zákon o ochraně ovzduší), ve znění pozdějších předpisů.



2) § 7 odst. 4 zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby

pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění pozdějších

předpisů.



3) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu

osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění

pozdějších předpisů.



4) § 19a zákona č. 408/2000 Sb., o ochraně práv k odrůdám rostlin a o

změně zákona č. 92/1996 Sb., o odrůdách, osivu a sadbě pěstovaných

rostlin, ve znění pozdějších předpisů, (zákon o ochraně práv k

odrůdám), ve znění pozdějších předpisů.



5) § 6 zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu osiva a sadby

pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů.



6) Příloha č. 4 vyhlášky č. 215/2008 Sb., o opatřeních proti zavlékání

a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.



Příloha 5



Požadavky na zneškodňování odpadů při průmyslovém zpracování partie

hostitelské rostliny označené za zamořenou podle § 5 odst. 1 písm. a)

nebo pravděpodobně zamořenou podle § 5 odst. 1 písm. b)



Způsob a místo zneškodňování odpadů při průmyslovém zpracování partie

hostitelské rostliny musí být v souladu se zvláštním právním

předpisem^1) Rostlinolékařskou správou povolený podnik pro zpracování

zamořené nebo pravděpodobně zamořené partie hostitelské rostliny pro

průmyslové nebo potravinářské účely podle přílohy č. 4 odstavce 1 písm.

c) a odstavce 2 písm. c) musí splňovat následující požadavky na

zneškodňování odpadů, aby bylo vyloučeno riziko šíření původce

kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby:



1. Pevný odpad ze zpracování hlíz brambor a rostlin rajčete Vyhozené

hlízy bramboru, bramborové slupky nebo plody rajčete a jiný pevný odpad

vzniklý při zpracování hlíz bramboru (např. zemina, kamení apod.) a

rostlin rajčete musí být:



a) odvezeny do řízené skládky odpadů a okamžitě převrstveny vhodným

materiálem (zemina, suť apod.). Odpad musí být přivezen přímo na

skládku a musí být zabalen tak, aby bylo během transportu vyloučeno

nebezpečí vypadnutí odpadu z dopravního prostředku.



Mohou být přitom využity jen takové skládky, u nichž je vyloučeno

nebezpečí úniku původce kroužkovitosti nebo hnědé hniloby do prostředí,

např. prosáknutím do zemědělsky využívané orné půdy nebo, v případě

hlíz napadených původcem hnědé hniloby, do povrchových vod využívaných

k zavlažování zemědělské půdy, nebo



b) spáleny s přihlédnutím ke zvláštnímu zákonu^2), nebo



c) zneškodněny jiným opatřením, které bylo předem písemně schváleno

rostlinolékařskou správou a pokud bylo prokázáno, že nehrozí

rozpoznatelné riziko rozšíření původce kroužkovitosti ani hnědé

hniloby. Tato opatření sděluje rostlinolékařská správa Komisi a

ostatním členským státům.



2. Odpadní vody při zpracování hlíz brambor a rostlin rajčete Před

zneškodněním je nutno odpadní vody, které obsahují na povrchu pevný

plovoucí materiál, přefiltrovat nebo odvést do usazovací nádrže, aby

byly tyto vody unášených materiálů zbaveny. Usazeniny musí být

zneškodněny postupem uvedeným pod bodem 1.



Odpadní vody je pak nutno:



– před vypuštěním zahřát po dobu minimálně 30 minut při teplotě

minimálně 60 °C uvnitř objemu,



nebo



- jinak zneškodnit způsobem předem schváleným rostlinolékařskou správou

tak, aby bylo vyloučeno riziko, že odpad přijde do styku se zemědělskou

půdou nebo vodními zdroji, které by mohly být používány k zavlažování

zemědělské půdy; podrobnosti o takovém způsobu zneškodnění sdělí

rostlinolékařská správa ostatním členským státům a Komisi.



-----------------



1) Zákon č. 185/2001 Sb., o odpadech, ve znění pozdějších předpisů.



2) Zákon č. 86/2002 Sb., o ochraně ovzduší a o změně některých dalších

zákonů (zákon o ochraně ovzduší), ve znění pozdějších předpisů.



Příloha 6



Očista a dezinfekce objektů a předmětů zamořených nebo podezřelých ze

zamoření původcem kroužkovitosti nebo původcem hnědé hniloby



1. Mechanická očista objektů a předmětů a likvidace nečistot a zbytků

Všechny pevné nečistoty, zbytky rostlin a hlíz se shromáždí (smetením,

vysátím průmyslovým vysavačem, popřípadě vyfoukáním nepřístupných míst

strojů a zařízení stlačeným vzduchem) a zavezou do skládky odpadu1).

Pro bezpečnější likvidaci je vhodné materiál předem asanovat podle dále

uvedeného postupu nebo jej před převrstvením zeminou prosypat chlorovým

vápnem nebo páleným vápnem v množství 5 kg na 1 m3.



Způsob a místo likvidace musí být v souladu se zvláštním právním

předpisem1) a musí je schválit rostlinolékařská správa.



2. Mytí a dezinfekce objektů a předmětů

Jakékoliv aplikaci dezinfekčního přípravku anebo prostředku musí

předcházet důkladná mechanická očista dezinfikovaných objektů a

předmětů podle bodu 1 této přílohy. Následně se objekty, stroje a

zařízení omyjí tlakovou vodou se saponátem, opláchnou čistou vodou a

nechají oschnout. Poté se dezinfikují dostupnými a k použití proti

původci kroužkovitosti nebo původce hnědé hniloby rostlinolékařskou

správou schválenými přípravky anebo dezinfekčními prostředky, použitými

v souladu s etiketou anebo rostlinolékařskou správou schváleným

technologickým postupem.



3. Asanace předmětů horkou vodou a párou

Provádí se máčením po dobu nejméně 30 minut při teplotě vody 65 st. C

nebo 15 minut při teplotě vody 80 st. C. K asanaci horkou párou se

používají stabilní nebo přenosné vyvíječe páry, teplota tlakové páry

musí dosahovat nejméně 80 st. C při době expozice nejméně 30 minut. Při

teplotě nad 100 st. C lze dobu expozice snížit na 15 minut.



4. Dezinfekce zeminy a organických odpadů

Provádí se propařením při teplotě 120 st. C nebo opakovaným propařením

při teplotě 70 - 80 st. C, nebo varem v tekuté fázi s vodou.



-----------------

1) Zákon č. 185/2001 Sb., o odpadech, ve znění pozdějších

předpisů.



1) Směrnice Rady 93/85/EHS ze dne 4. října 1985 o ochraně proti

bakteriální kroužkovitosti bramboru.



Směrnice Rady 98/57/ES ze dne 20. července 1998 o ochraně proti

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.



Směrnice Komise 2006/56/ES ze dne 12. června 2006, kterou se mění

přílohy směrnice Rady 93/85/EHS.



Směrnice Komise 2006/63/ES ze dne 14. července 2006, kterou se mění

přílohy II až VII směrnice Rady 98/57/ES.



2) § 2 odst. 1 písm. b) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu

osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění

pozdějších předpisů.



3) § 31 odst. 2 vyhlášky č. 215/2008 Sb., o opatřeních proti zavlékání

a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.



4) § 2 odst. 1 písm. o) zákona č. 219/2003 Sb., o uvádění do oběhu

osiva a sadby pěstovaných rostlin a o změně některých zákonů, ve znění

pozdějších předpisů.